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(無題) 削除/引用 No.1705-9 - 2008/08/04 (月) 23:31:58 - しちみ 普通、ベクターをPCRで増やすことはしませんよ。 最初の投稿の >PCRで増やした平滑末端のインサートとベクターをつかって から、 >PCRで増やしたベクターとインサートをそのまま使えないかと これを読み取れた人はたぶん居ません。 最小でも1.8kbpくらいにはなるでしょうから、PCRエラーによる変異のリスクが高くなります。 大腸菌内で増やすほうが何桁もリスクが低いです。 それに平滑末端になる制限酵素サイトって最も汎用性があるので大抵のベクターにはあると思います。 特殊な用途のベクターで平滑末端酵素サイトのないものもあるかもしれないけど、よほど巨大なものでなければ内部切断しない酵素サイトを作ればいいでしょう。 もし巨大なプラスミドならPCRは難しいと思われます。 ＃例えばQuickchangeのような方法論もあるにはあるけど．．． ＃私が時代遅れかしらん。

(無題) 削除/引用 No.1705-8 - 2008/08/04 (月) 17:59:21 - 小言幸兵衛 少々乱暴？

(無題) 削除/引用 No.1705-7 - 2008/08/04 (月) 17:54:14 - けろりん 皆様、返信ありがとうございました。 あいにくインサートもベクター上にも適当な制限酵素サイトがありませんでしたので、PCRで増やしたベクターとインサートをそのまま使えないかと考えたのですが、少々乱暴だったようです。 皆様のメッセージによって勉強させていただきました。 ありがとうございました。 今後はインサート側のリン酸化を考えていきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1705-6 - 2008/08/04 (月) 15:54:57 - おお もし、ベクターの平滑末端のセルフライゲーションによってライゲーション部位に制限酵素認識配列ができるが、インサートが挿入された時、その認識配列が一つも出来上がったプラスミドにないのであれば、ライゲーション中または後その制限酵素で切って、トランスフォーメーションという手が取れます。この時セルフが出来にくくなるようにインサート過剰にしておいた方がいいですね。 私はPCRプロダクトを平滑でよく入れますが。プライマーを研究室に転がっているPNKで燐酸化してからPCRをかけ、ベクターを脱燐酸化してPCR産物とライゲーションします。大抵効率よく入りますよ。 PCRプロダクトは念のためクレノーをかけることがよくあります。

(無題) 削除/引用 No.1705-5 - 2008/08/04 (月) 12:31:04 - 自殺平滑サイト ベクターに制限がないなら、自殺ベクターを使う手もあります。 これなら、インサートのリン酸化も、ベクターの脱リン酸化も不要です。 自殺ベクターは数社から商品化されていますよ。

(無題) 削除/引用 No.1705-4 - 2008/08/04 (月) 11:39:25 - Pumpkin >できればリン酸化しないで進めたい 理由はわかりませんが、プライマーの5'端をリン酸化しておく、という手もありますが、既にプライマーはあるご様子ですね。TaKaRaやTOYOBOから平滑末端PCR産物を効率よくクローニングするためのライゲーションキットが出ていますので、このようなキットを使えば、T4 Polynucleotide Kinaseなどを単品で購入しなくてもワンステップでいけますよ。

(無題) 削除/引用 No.1705-3 - 2008/08/04 (月) 11:36:24 - ~ Invitrogenに16,000円払って、両側のプライマーにリン酸化してもらえば、 自分でリン酸化しないで、脱リン酸化ベクターに挿入できます。 制限酵素処理とうまく組み合わせれば、 リン酸化されていないインサートと、脱リン酸化していないベクターをライゲーションして、 それなりの頻度で目的のクローンを得ることは出来るでしょう。 (EcoRVで切断して、ライゲーション後にEcoRV処理するなど)

(無題) 削除/引用 No.1705-2 - 2008/08/04 (月) 11:29:15 - 白頭 リン酸化されていないインサートと、脱リン酸化されたベクターとはライゲーションされません。したがって、ベクターを脱リン酸化することなくライゲーションに供することになりますが、そうすればもちろんほとんどのライゲーション産物は自己環状化したベクターになるでしょう。 今後のためにも、ライゲーションの原理を少し勉強されてはいかがでしょうか。

平滑末端のライゲーション 削除/引用 No.1705-1 - 2008/08/04 (月) 11:01:25 - けろりん PCRで増やした平滑末端のインサートとベクターをつかってライゲーションを考えています。 このときにインサートかベクターをリン酸化する必要はあるのでしょうか？ できればリン酸化しないで進めたいと思っているのですが、ライゲーション効率が低下する以外に何か理由があるのでしょうか？ 基本的な質問で申し訳ありませんが、よろしくお願いいたします。

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