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(無題) 削除/引用 No.1685-10 - 2008/08/02 (土) 11:50:32 - シュン もし、共焦点レーザー顕微鏡を使われていて、同時に赤と緑を励起しているようでしたら、別々でレーザーを当てて、励起させてその後重ね合わせをした方が良いかもしれません。 赤のシグナルが非常に低いときは、それを検出するためにシグナルを上げますが、この時に緑の蛍光を拾ってしまうことがあります（http://invitrogen.co.jp/catalogue/molecular_probes/cell_bio_new/content01/index.html）。 また、ぶりぶりさんがコメントされているように、それぞれ単独で染めて、それぞれのレーザーで本当にそれぞれの蛍光が励起されないか検討された方が良いと思います。波長が５０nm以上離れていれば大体大丈夫だと思いますが、共局在を見るときは単独で染めてバックグランドがどれくらいあるかは確認する必要があると思います。

共焦点だからといって 削除/引用 No.1685-9 - 2008/08/01 (金) 21:48:49 - ぶりぶり 　最近のコンフォーカルは制御するコンピューターの性能が良く、逆にクロストークを生み出す場合もあるので、信頼しすぎるのも危険です。 　勝手に電圧やら検出限界を変えてくれるので、一色で綺麗に染まっている場合は非常に便利ですが、薄く染まっている場合には自動的に無理やり感度を上げて画像取得してしまうので、ノイズがめだってきます。 　ローダミン系単独で染めて、B励起の条件で観察したときに全く光っていない条件と、FITC系単独で染めてG励起の条件で観察したときに全く光らない条件を決めてから、2重染色するぐらいの検討は必要だと思います。 （事実としてメーカー技術マンが、短波長をあてて長波長色素が光ことを注意する人は多いが、長波長をあてて短波長側の色素が検出される場合もあるので、そこまで検討しないとダメですよ！特に自家蛍光のある時は慎重に！と親切かつ厳しい口調で教えて頂いたことがありました）

返信ありがとうございます。一応共焦点顕微鏡を使って実験しています。 削除/引用 No.1685-8 - 2008/08/01 (金) 21:21:35 - nujabes 実験をうまく進めるには、原因の追究をすることが大事なことに改めて気づかせていただきました。 　まず原因が二次抗体にあるのか一次抗体にあるのかもしくはそのどちらでもないのかということをしらべなければいけないことを実験しようと思います。

返信ありがとうございます。一応、共焦点顕微鏡を使って実験をしています。 削除/引用 No.1685-7 - 2008/08/01 (金) 21:12:02 - nujabes やはり、原因追求のためにpre実験をしなければいけないをしなければいけない事に気づきました。

一応共焦点顕微鏡 削除/引用 No.1685-6 - 2008/08/01 (金) 21:08:54 - nujabes

(無題) 削除/引用 No.1685-5 - 2008/08/01 (金) 12:20:32 - 組織 一応、蛍光色素のクロストークもチェックした方が良いと思います。通常の蛍光顕微鏡だと、シグナルが他のフィルターにもかぶることがあります。コンフォーカル顕微鏡を使われているなら、気にする必要はありません。

(無題) 削除/引用 No.1685-4 - 2008/08/01 (金) 01:43:41 - sea すでにより専門的なコメントが出ているので あまり有用じゃないコメントかもしれませんが、 あくまで一般論として受け取ってください。 二重染色での二次抗体のクロスリアクトの可能性を否定するために、 一次抗体をomitしたコントロールを取る、というのは よくやられると思います。 下のような感じ。 A: 一つめ、二つめの染色とも通常通りやる B: 一つめの一次抗体を省略、あと一つ目の二次抗体以降は通常通り C: 一つ目の染色はフル、二つ目の一次抗体だけ省略、二次抗体以降は通常通り D: 一次抗体を二つとも省略 これでnegativeなはずのところが本当にnegativeか確認して、 二次抗体のクロスリアクトが疑われるようなら (1) 一つめと二つめの染色の順番を入れ替えてみる (2) 交差反応性を抑えた二次抗体を購入する また上記のコントロール実験の結果次第で 微妙に別の対策もあると思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1685-3 - 2008/08/01 (金) 01:34:38 - nujabes 確かに二次抗体のクロスリアクトは考えられそうですね。どうやったらクロスリアクトを防げるんでしょうか？一次抗体のクロスリアクトは考えられないんでしょうか？アドバイス頂けないでしょうか。 アビジンービオチンを利用する方法が手っ取り早いかもしれないんですが研究室自体がお金なくて…出来れば今の持っている抗体でなんとか出来れば嬉しいと考えてます。

(無題) 削除/引用 No.1685-2 - 2008/08/01 (金) 00:59:24 - 僕のとこもラフトやってます。 二次抗体のクロスリアクトの可能性が高そうですね。 Naｖの検出は抗体を用いて、ラフトマーカーにはコレラトキシンBサブユニットCtxBを用いたらいかがでしょう？ CtxBにビオチンが付いているものをご購入いただいて、蛍光標識アビジンで検出すればクロスリアクトを考えなくていいのではないでしょうか？

蛍光二重染色法のmergeがうまくいきません。 削除/引用 No.1685-1 - 2008/08/01 (金) 00:31:06 - nujabes 僕は、raftについて研究しています。 まず最初に色々な抗体をもちいてraft局在化・非局在化を見るために、raftマーカーとchannelやreceptorとの二重染色をしています。 　 　そこで、まずNav1.7（緑）とraftマーカーであるflotillin-1（赤）を二重染色してみたところみごと黄色にmergeされていることがわかったので、他のNavのサブタイプのraftへの局在化を知るために二重染色を行った結果すべてのNavでflotillin-1との共存が見られました。 　しかし、flotillinの染色のされ方がNav1.7、Navのサブタイプの染まり方がすべて違うのに黄色のmergeが完璧に見られたのでこれは抗体間の交差反応でmergeしている様にみえているだけではないかと考えています。 何かいいアドバイスあればおしえて下さい。 ちなみに使っている一次抗体のsouseはanit-mouseとanti-rabbitです。 よろしくおねがいします。

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