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多数ご意見ありがとうございます 削除/引用 No.1681-16 - 2008/08/01 (金) 18:33:12 - transplant とりあえず、APさんご指摘のレポート及びおおさんご指摘のタカラのカタログにて勉強してみることにします。 APさんご指摘のアンビオンのDNaseものは買おうかどうか迷っていました。（まだ以前に購入したDNaseが残っていますので勿体無いなと思い、買うには至りませんでしたが。） ここまでの意見を軽くまとめますと（あくまで一般的なRTに使用するRNAです） AGPC法なりでRNA抽出＞イソプロ沈殿＞RNaseFree水に溶解＞DNase処理（望ましくはCa+含バッファー）＞EDTA添加熱処理（pH5以下もしくは9以上）＞イソプロ沈殿＞0.1ｍM EDTAを含むRNaseFree水に溶解 （RTのプロトコルによる熱処理ステップなどを考慮すればさらに簡略化できそうですね） このようなプロトコルでDNaseは完全に止まると思いますが、いかがでしょう？ 矛盾点、改良点などございましたらご指摘いただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.1681-15 - 2008/08/01 (金) 15:48:24 - AP もうひとつBioTechniquesから DNase Iの熱失活は、中性域のバッファー中では不完全で、 pH 5以下、pH 9以上だと完全に失活するそうです。 DTTの添加も効果があるそうです。 pH 9のバッファーの選択として、PCRバッファーが便利だろうと提案されています。 でも二価陽イオンが入っているとRNAが分解するというのと両立しませんが。 http://www.biotechniques.com/default.asp?page=search

(無題) 削除/引用 No.1681-14 - 2008/08/01 (金) 15:23:03 - AP >[Re:10] transplantさんは書きました : > DNaseで処理し、EDTAで止めたサンプル（私の場合はtotalRNAですが）をエタチンします。その後リンスしてヌクレアーゼフリーの水（EDTA不含）に溶かすと、DNaseは活性を取り戻すのでしょうか？ DNase Iの不可逆的な失活方法を検討したreportがありました。 http://www.biotechniques.com/default.asp?page=article_archive&subsection=article_display&year=2000&issue=8/1/2000&id=81200012&prevpage=search （BioTechniquesの無料登録で全文読めます） 緒論によると、DNase Iを完全に不可逆的に失活させるには、 十分な熱処理、またはPCI抽出とEtOH沈殿というのがコンセンサスみたいで、 EtOH沈殿だけでは残存活性があるようです。 まあ、ニッポンジーンのDNase Iの説明書なんかでは、失活の熱処理がえらく軽くて（RNA保護のためか？）、この条件では残存活性があるけれど、RT-PCRにはこれで十分といっていたりしているので、多少の残存活性は問題ないのかもしれません。 また、上のreportには、ほかにもいろいろためになることが載っていて、 ・DNase Iの熱失活はEDTAなしでもできるにしても、二価カチオン存在下で熱処理するとRNAが加水分解するので、これを防ぐのにキレーターが有効で必須（これって常識ですか？）。 ・EDTAを加えてDNase Iで熱失活したRNAサンプルは、そのまま使っても、少なくとも持込のEDTAが0.125 mMであれば、ダウンストリームのRTやPCRを阻害しない。 ちなみにAmbionではこの目的のために、modifyしたDNaseとDNase除去液（DNase Removal Reagents) のセットを売っているみたいですね。 http://www.ambion.com/jp/catalog/ProdGrp.html?fkApp=3&fkSubApp=12&fkProdGrp=48

(無題) 削除/引用 No.1681-13 - 2008/08/01 (金) 14:15:17 - カイアジェン 誤解を招く書き方でしたが、組換え型だからと言いたかった訳ではなくて、RNaseOUTはいわゆる「RNaseインヒビター」タンパク質だからというつもりでした。

(無題) 削除/引用 No.1681-12 - 2008/08/01 (金) 13:30:25 - おお >[Re:10] transplantさんは書きました : > ここでちょっとズレるのですが、 > DNaseで処理し、EDTAで止めたサンプル（私の場合はtotalRNAですが）をエタチンします。その後リンスしてヌクレアーゼフリーの水（EDTA不含）に溶かすと、DNaseは活性を取り戻すのでしょうか？ そんなに強い酵素ではないという印象がありますので、ほとんどリカバーしないのではと思っています。 Heat Inactivationというても取れますので、RTであればエタチンして、リカバーしたRNAとオリゴdTとdNTPをまぜて、変性処理で完全につぶすというのでもいいのではないでしょうか。 http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0303.asp タカラはエタチンやフェノクロ、ヒートイナクチベーションといった処理の各酵素に対する有効せいを表にしてたと思います。主に制限酵素についての情報でしたが、そういうところに載ってないかなとちょっと思ってます。 DNaseIはカルシウム依存性の酵素なのでEGTAを使ってストップをかけたいところです。プロメガのDNaseIのストップバッファーはEGTAが入っていたと思います。 > また、RNase阻害剤として売られている「RNaseOUT」などについてもご意見いただけると幸いです。 RNase阻害剤はRTでは使わないですね。RNaseフリーの試薬をつかって、RNaseフリーのRNAを精製しておいて、阻害剤がないとうまく行かないぐらいはいっている状態では、水に解けている状態でRT用のミックスを作っている間にアウトでしょうと個人的に思っているのですが、、、 >[Re:11] カイアジェンさんは書きました : > > RNaseOUTは組換え型RNaseインヒビターなので、EtOH沈殿を経てもRNaseにくっついたままだと思います。 組換え型だからくっついたままという理屈は何でしょうか、、、遺伝子が改変されているのでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.1681-11 - 2008/08/01 (金) 11:40:56 - カイアジェン DNaseを含む溶液にEDTAを入れEtOH沈殿する場合は、EDTAが上清として除かれるでしょうから、沈殿を水に溶かした時ではなく（２価イオンが無いので）、次にそれをMg2+を含むバッファーを混合したときにDNaseが働きうると思います。 RNaseOUTは組換え型RNaseインヒビターなので、EtOH沈殿を経てもRNaseにくっついたままだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1681-10 - 2008/08/01 (金) 01:20:56 - transplant ヌクレアーゼはエタチン中など有機溶媒の中では動けない、と聞いたことがあるのですがどうなんでしょう？ （残存していれば）その後にＴＥ溶解するとまた効きそうですね。 リゾチウムで膜破壊した上でRNaseだと。。。 ゴージャスでパワフルなＳｏｌ１になりますね（笑 ここでちょっとズレるのですが、 DNaseで処理し、EDTAで止めたサンプル（私の場合はtotalRNAですが）をエタチンします。その後リンスしてヌクレアーゼフリーの水（EDTA不含）に溶かすと、DNaseは活性を取り戻すのでしょうか？ また、RNase阻害剤として売られている「RNaseOUT」などについてもご意見いただけると幸いです。 ＲＮＡサンプルは、ＴＥに溶解しすると逆転写に阻害がかかると考え、こわごわですがこの方法で処理したものを逆転写しているのですが。。。（一応今のところは問題は出ていません。）

(無題) 削除/引用 No.1681-9 - 2008/07/31 (木) 23:53:10 - おお RNaseAはSDSなどで変性させても、SDSを除くとrenatureすると言われています。SOL1で加えることがあると思いますが、Sol3から、イソプロチン、TEでのリカバーあたりのところできいているのではないでしょうか。SOL1にリゾチウムを加えている場合はSOL1のときにも効果があると思います。

(無題) 削除/引用 No.1681-8 - 2008/07/31 (木) 22:24:05 - しちみ SOｌ１に入れるRNaseは（全部ではないけど）最後まで残ると思いますよ。 中和すると活性が出るんでしょうね。 それくらいのことでRNaseが死んでくれたらいいのにね。って自分も思います。

そういえばそうなんですが（笑） 削除/引用 No.1681-7 - 2008/07/31 (木) 21:50:19 - transplant 確かにテェック用になるので悪くてもサンプル数稼げればいいかなと思うんですが．．． でも最初から悪いのがわかってると，ちょっとでもマシなものをとりたくもなるんですよね． ＞パンタさん ちなみにですが，入れる時と入れない時の比較はされたことありますか？ どれくらい変わってくるんでしょう？ （一口に比較といっても収率，精製度などファクターが多いので，個人的な感想で構いません．）

(無題) 削除/引用 No.1681-6 - 2008/07/31 (木) 21:22:03 - パンタ ＞ミニプレって，溶菌が甘いと収率ガタ落ちするじゃないですか？ 確かにそう思います。菌体量が多すぎて、処理の限界量を超えてることが原因な気がします。 あと、これは全くの個人的感想ですが、ボイル法ってあんまり質の良いプラスミドが取れない気がします。もちろんチェック用なら問題はないんですが、シーケンスその他に使うときはアルカリ／SDS法で取ってます。 ちなみに私はボイル法の時、リゾチーム入れません。入れなくても、チェック用ならOKです（←あ、これが質の悪い原因？？）

ありがとうございます 削除/引用 No.1681-5 - 2008/07/31 (木) 20:14:15 - transplant ミニプレキットは最初から入ってるものが多いと思いますが，私はsol1に入れたり後で処理したり，バラバラです． はじめに入れると効きが弱い気がする時がありますので，きっちりする時はTE溶解後に，サンプル多い時などは最初から入れてます． あぁ，やっぱりアルカリくらいではRNase変性しないんですかね．．．それとも中和することで活性取り戻しているのでしょうか？ どちらにせよPCI抽出で除去されるでしょうし，PCI投入までのどこかで効いてるのでしょうが． リゾチームはそんなに使った経験がないんですが，今回ボイル法をするにあたり，ケンダク後から沸騰水に入れるまでの数分で完全に溶菌できるほど活性が高いのかな，とふと疑問になったのです． ミニプレって，溶菌が甘いと収率ガタ落ちするじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.1681-4 - 2008/07/31 (木) 19:22:37 - カイアジェン ボイル法のリゾチームは、入れてすぐ（室温）に効いているのだと思います。そのくらいで十分ということなのでしょう。 QiagenのキットなどだとRNase Aをsoln Iに入れていますが、これはいつ効いているんでしょうね。大過剰なのでsoln IIIを入れて氷上に置いている間かな。

(無題) 削除/引用 No.1681-3 - 2008/07/31 (木) 19:18:11 - よっしー > アルカリSDSでは、フェノクロ・エタ沈の後の沈渣に加えるのではないでしょうか？ 私もそうだと思っていましたが，今のラボは最初から入れています． RNaseがそんなことで失活してくれるなら楽でいいとボスは言ってます．

(無題) 削除/引用 No.1681-2 - 2008/07/31 (木) 18:31:00 - EcoRI >アルカリ法ではRNase（至適温度３７℃）を集菌ペレットのケンダク液に加えることが多いで アルカリSDSでは、フェノクロ・エタ沈の後の沈渣に加えるのではないでしょうか？

プラスミドミニプレの添加酵素 削除/引用 No.1681-1 - 2008/07/31 (木) 17:59:18 - transplant ボイル法ではリゾチーム（至適温度５０℃）アルカリ法ではRNase（至適温度３７℃）を集菌ペレットのケンダク液に加えることが多いですが，これらの酵素は具体的にいつ効いているのでしょうか？？ ステップとしてボイル法だと加えてすぐ沸騰水，アルカリ法ではすぐNaOHとSDSが入りますよね？これで酵素がつぶれそうな気がするのですが．．．

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