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(無題) 削除/引用 No.1675-9 - 2008/08/01 (金) 10:09:28 - GC そもそもprimerの配列云々を論じる前に、gPCRで目的産物が得られないということが問題なのですよね。 でしたらgenomicDNAの抽出は大丈夫か、PCR試薬が使える状態なのか、他の細胞からのgenomicDNAではダメなのか、primerはヘアピン、dimerを作るなど扱いにくいものではないか、目的産物の長さは？、GC richなど増えにくい配列ではないか、それを増幅するのに適した酵素なのかなどです。それぞれのステップが上手く言っていることは確認されましたか？ >ノンスペバンドが出たため、アニーリング温度を一度変えた途端にバンドがでなくなったり、 >何をしても全く走らなかったり・・・ >今までこのような経験が無かったので、配列が違うのでは？と疑っています。 そうですか...？ アニーリング温度を一度変えることで増えなかったり増えたりすることは良くあることのように思いますが... 経験的にはPCRで一℃の温度変化は大きいと思います。サーマルサイクラーの機種が違う、当然使う酵素が変わった場合にも増えなくなることもありますよね。

(無題) 削除/引用 No.1675-8 - 2008/08/01 (金) 09:45:20 - ~ >目的サイズの部分にバンドが確認できれば、それなりに対処方法はあると思うのですが、それすら見えない状態なので、相談しています。 別に、PCRで目的のバンドが増えない場合のPCRでの対処法もあると思いますが… すでに一部は先に書かれていて、回答が得られていないものですが そもそもご自分ではどこのデータベースを使っているのですか？ 調べたデータベースの情報は、"そのヒト血球系細胞"の配列情報なのですか？それとも別の細胞の情報なのですか？ ヒトならば、別の細胞などのgDNA情報が複数あると思いますが、それらと参考にしている配列は同じ配列なのですか？ N末部分だけとか、C末部分だけでも増えないのでしょうか？ 別のヒト細胞では増えるのでしょうか？ 酵素は、何種類試しましたか？ PCRの条件に問題が無く、配列に問題があるということを示すデータがあるのであれば、 そのデータを元にどこを変更すれば増えるようになるかが分かるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1675-7 - 2008/08/01 (金) 07:34:33 - おお >[Re:5] シーケンスさんは書きました : > gDNAはヒト血球系細胞から抽出し、RTなどはせずに > 25ngのgDNAをテンプレートとしてPCRを行なっています。 > 癌細胞とか使っていて、そかがデリーションしているとか、、、、

Re: 削除/引用 No.1675-6 - 2008/08/01 (金) 07:29:36 - UC 原因がどこかは別として、とりあえずチェックならすぐに済むので。 In-Silico PCR：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr 一応言っておくと、ヒットしなかったから、かからないプライマーだ という訳ではありません。

(無題) 削除/引用 No.1675-5 - 2008/08/01 (金) 04:14:04 - シーケンス 回答ありがとうございます。 現在プライマーの組み合わせとしては６種類試しています。 ノンスペシフックなバンドが大いにしても、 目的サイズの部分にバンドが確認できれば、それなりに対処方法はあると思うのですが、それすら見えない状態なので、相談しています。 gDNAはヒト血球系細胞から抽出し、RTなどはせずに 25ngのgDNAをテンプレートとしてPCRを行なっています。 配列を疑う点は、何回やっても出ないので、 皆さんが使われているサイトでの確認をしたいと思い、相談しました。 gDNAはSNPsも多く存在するため、その報告の有無もかねて確認したかったので。

(無題) 削除/引用 No.1675-4 - 2008/07/31 (木) 11:42:14 - おお とくにcDNA以外の配列は個体差をなるべく考慮できるように、できるだけの情報を集めるとかした方がいいかもしれませんね。最近は便利になってきてNCBIのデーターでもSNPsなど把握できるようになってきてます。cDNAでも例外ではないのですが比較的問題が起きにくいとも思えます。 実験が特定の細胞を使う場合は、その細胞の配列が載っているデーターを探すのかベターでしょう。そういうレベルではどこのデーターベースがいいというレベルではないですね。どこが間違っているというレベルでもないと思います(間違っているのもあるかもしれませんが)。 ご指摘の内容から、プライマーの配列が悪いのかどうかは分かりませんが、個体差を考えるとサンプルにあわないプライマーを使っているかもしれないとお考えください。 プライマーの配列があっていても、プライマー自身いい条件を見つけるのが難しいものを作ってしまったという可能性もあります。 なにかポジコンになるものを使ってますか?PCR自身、サンプルの状態いろいろなことを考えないといけないかとも思います。例えばゲノムのほかの場所は同じサンプルを使って同様のPCRで増えますか?gDNAの発現と書いてますが、たぶんRTーPCRをしているのだと思いますが、インターなるコントロールとかPCRがかかりますか? 他の方が指摘しているように情報が不足してますので直接的な回答ができませんが、参考になればと思います。

(無題) 削除/引用 No.1675-3 - 2008/07/31 (木) 09:49:34 - とう >primerがうまく走りません。配列が違うのでは？ と書かれておられますが、書かれた内容から判断するに、なぜそのような結論に至ったのかが全く分かりません。おそらく、他の情報をお持ちで結論づけていると思われますが、情報をもう少し可能であれば提示して頂かないと、答えようが無いと思います。 アニーリング温度を変えたらバンドが出なくなる事は、良くある事で、言ってみれば当たり前の現象とも言えます。PCRの条件は、改善すべき状態によって、変更すべき点が幾つかありますよね？当然、変更、検討された情報を、可能な範囲で提示できませんか？答えるにも、答えようが無いですよ。

(無題) 削除/引用 No.1675-2 - 2008/07/31 (木) 09:31:04 - ~ 使われている論文か、NCBIのサイト。 逆に、 どこの情報を元に設計して、 それとご自分の手持ちの配列が同じである根拠は何ですか？ 少しずらして設計したプライマーでも駄目なのですか？ どのくらいのプライマーの組み合わせで検討したのですか？ 酵素やバッファーについてはどのくらい検討しているのですか？ 現象としては、期待しているバンドが出ずに、 PCRの再現性も取れていないということですよね。 書かれている情報からだけだと、 単にPCRがうまくいっていないだけでも同じ結果は見られますので、 なぜ、配列が正しいかについて注目しているのか不思議なのですが。

DNA・RNA の配列 削除/引用 No.1675-1 - 2008/07/31 (木) 03:59:52 - シーケンス いつも参考にさせてもらっています。 突然ですが、皆様は、ＰＣＲでのプライマー設計などでどのサイトで得られるＤＮＡまたはＲＮＡの配列を参考にしていますか? 現在、genomic DNAを用いたpromoter配列の解析および目的遺伝子のgDNA発現の解析を行なっていますが、 primerがうまく走りません。 30bのプライマーを用いていますが、 ノンスペバンドが出たため、アニーリング温度を一度変えた途端にバンドがでなくなったり、 何をしても全く走らなかったり・・・ 今までこのような経験が無かったので、配列が違うのでは？と疑っています。 安直な考えで申し訳ありませんが、皆さんが参考にしているサイトがあれば教えてください。

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