全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1670-11 - 2008/07/31 (木) 10:26:59 - EcoRI 皆様ありがとうございます。 実は発現系がpCold-Iというベクターを用いていて、これが２４時間のインキュベートを必要としているのです (ご存知の方も多いかと思います。) さらに、ウサギへの免疫用のタンパク質なので、大量に(~1 mg)欲しいところなのです。 前培養、本培養・誘導、発現量の確認だけで３、４日かかってしまうのです。 なので、できるだけ発現の多いクローンをkeepしておきたい、と考えたのですが… グリセロールストックで、発現量が落ちることも有るのですね。 まぁ、生物相手なので、わからないではないですが。 まとめると、 毎回、形質転換させてから、培養・誘導させた方が良い。 しかし、グリセロールストックから培地にストリークして、シングルをいくつか拾って、 発現がそこそこのものを発現に持っていく。 このような指針でよろしいでしょうか。 もちろん、タンパク質によりけりである、ということもあると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1670-10 - 2008/07/30 (水) 23:05:04 - おお あと、大腸菌のクローンのバリエーションが出てきているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1670-9 - 2008/07/30 (水) 22:51:39 - おお 私は毎回トランスフォーメーションするのがいいかと思います。ボスはグリセロールストックOKというのですが、起こす度に発現が落ちてきています。もういい加減気がついてほしいのですが、、、、 グリセロールストックでも、プレートに線画培養しクローンを何個か拾えばいいかと思います。 あとトランスフォーメーションで、クローンを拾って、発現をチェックした時発現量が極端に多いクローンは避けた方がいいと思います。へいきんてきな はつげんをしているくろーんをひろうほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.1670-8 - 2008/07/30 (水) 20:38:57 - A 大腸菌であれば経験的にですが同じクローンであっても グリセロールストックを作成したタイミングが違えば 生えがわるいことはあります。原因ははっきり知りませんが。 基本的にはグリセロールストックよりも、新しくプレートに 引いて元気にしておいてから前培養に使ったほうが生えが いいように思います。もしこの先長い間グリセロールストック から始めて蛋白質安定して発現させたいのであればおおめの グリセロールストックを準備してそれを200uLぐらいに分注、 ディープフリーザーで保存し（頻度にもよりますが100-200tubesも あればいいかと）、毎回使い切りにすれば安定した発現が 得られるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1670-7 - 2008/07/30 (水) 20:37:53 - EcoRI ドナドナ様 後学のために教えてください。 グリセロールストックから出発して痛い目にあわれた、とは 具体的にはどのような現象を指しておられるのでしょうか？ この現象が起きたとき、形質転換まで戻る という指針などがあれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1670-6 - 2008/07/30 (水) 20:23:49 - ドナドナ 私の場合、グリセロールストックから出発しても何度か痛いめを見たことがあるので、毎回新たに形質転換し直しています。発現させようとするタンパク質によりけりなのだとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1670-5 - 2008/07/30 (水) 19:23:52 - EcoRI >プレート上の形質転換体を４℃に取っておいて後日使うというようなことは、発現量がバラつく原因なので避けるべきです。 了解しました。 参考までにお伺いしましが、ドナドナ様はどのように菌を維持しておられまか？ 形質転換して出て来たコロニーは発現を誘導しつつ、グリセロールストックとしているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1670-4 - 2008/07/30 (水) 19:21:00 - ドナドナ 大腸菌の発現系だという前提ですが、コロニー毎のバラツキは良く経験します。遺伝的変異にしては頻度が高すぎるので、プラスミドのコピー数がぶれるせいかなと思っています。また、プレート上の形質転換体を４℃に取っておいて後日使うというようなことは、発現量がバラつく原因なので避けるべきです。

(無題) 削除/引用 No.1670-3 - 2008/07/30 (水) 19:20:53 - EcoRI あ、書き忘れてました、申し訳ないです。 そうです、おっしゃる通り、大腸菌です。

(無題) 削除/引用 No.1670-2 - 2008/07/30 (水) 19:14:39 - A おそらくそうだと思いますが念のため。 発現系は大腸菌ですよね？

同一クローン由来のクローンで発現量が違う？ 削除/引用 No.1670-1 - 2008/07/30 (水) 17:36:27 - EcoRI お世話になっております。 現在、組換えタンパク質を精製しています。 １つの形質転換体を培養して、選択培地に撒いて得られたクローン毎(理論上、差異はないはず) の組換えタンパク質の生産量が異なる、 ということはあり得ることなのでしょうか？ 同じクローン由来だから、ということで、別の日に別のクローンから組換え体を精製したところ、 収量に５倍程度の差が認められましたので、 少し気になった次第です。 もちろん、濁度を完全に合わせることは困難なので、直接的な比較はできない、と思います。 しかし、ある範囲内に収めることができれば、それほど発現量に差はないと考えます。 収量が低くても、培養を繰り返せばいいので、さほど問題ではないですが。 ちなみに、当ラボでは、培養スケールは 1 L が限界です。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---