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(無題) 削除/引用 No.1663-5 - 2008/07/30 (水) 22:41:37 - おお >[Re:4] みさんは書きました : > 結構ロスがでるか，最悪全て流れてしまうかのどちらかだと予想していたんですけどね．．． この予想は当たっていると思います。少なくともその傾向にあるのではと思います。カラムはシリカを使ったもので、高い塩濃度かアルコールの存在下で核酸の吸着を維持しているからです。QIAGENのキットはDNaseのバッファーの塩濃度を通常の物より上げているようです。 プロメガもこの手のキットを売っていたと思いますので、DNaseだけプロメガのキットの方法に切り替える手はあるかもしれませんが、保障はできません。

(無題) 削除/引用 No.1663-4 - 2008/07/30 (水) 20:10:39 - み しちみ様，おお様 レスありがとうございます． 確かに，バッファーの影響は当然あるだろうと考えていました．なので，カラム上でDNase処理後，遠心せずにそのまま洗浄バッファーを入れてしまえばいけるかなと何となく考えていました．結構ロスがでるか，最悪全て流れてしまうかのどちらかだと予想していたんですけどね．．． 2,3日ほど他の実験をやらないといけなくなりましたので，引き続きご意見を頂ければ幸いです． よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.1663-3 - 2008/07/30 (水) 13:36:40 - おお http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/Products?OpenDocument&parentid=975942&moduleid=166709 わたしもQIAGENのきっとで、同じようなことを考えたことがありますが、情報不足であきらめGEのきっとに変更しました、このキットはDNaseがついてきますので別売で買う必要がなく、ねだんもQIAGENよりやすかったと思います。 QIAGENでの場合であれば他社のDNaseをつかうなら、一度溶出してからDNase処理のほうがいいと思います(というのは、QIAGENのオンカラムの処理は通常の条件より高い塩濃度を用いてDNase処理しているようでDNase自身になにか細工がないかとか勘ぐったりとか、活性の単位も他社が使っているのと違う単位を使ってたりということです。単位についてはタカラのホームページで定義が違うものの目安としての換算ができるますが、、)。そのごはどの程度の精製度のRNAが必要がひつようかによるとおもいますが、エタチンぐらいでも何とかなることもおおいいのではと思います。ただし、ステップは確実にふえます。 http://www.chem.agilent.com/Scripts/PDSLocal.asp?lPage=18459&LL=Y&CountryCode=JP DNase処理なしでも、十分DNAのコンタミが抑えられるキットといううたい文句のものもチラホラみうけます。使用したことはないのですが、サンプルとかもらえるなら使ってみるのもてかもと思います。ただゲノムのコンタミについては配慮されているでしょうけど、なにか過剰発現した時のプラスミドやエピソーマルなDNAをどこまで抑えられるかはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.1663-2 - 2008/07/30 (水) 12:14:50 - しちみ オンカラムDNase処理をしたことはないのですが、他社製の酵素を使う時のバッファー変更によってRNAも溶出してしまう心配がありますね。 RNeasy Plus Mini KitにはゲノムDNA除去カラムが付いているので便利ですよ。 値段も大して変わらなかったような気がします。

DNase処理を追加したいです． 削除/引用 No.1663-1 - 2008/07/30 (水) 11:06:36 - み キアゲンのRNeasy Mini Kitを使いRNAを取っています． 表記の通りDNase処理を追加したいと思っていますが，オプションのDNaseではなくタカラバイオのDNaseを使いカラム上で処理できないかと考えてます． 無謀かな？とも思っていますが，オプションのDNaseは価格が高い上に50反応分しかないので多検体処理しなければならない当方には手が出せません． とりあえず試してみるつもりですが，どなたか同じようなことを考え，挑戦された方がいらっしゃればどの様な情報でも構いませんので御教授下さい． なお，キアゲンに問い合わせたところでは，RNAを取った後にDNase処理して，再度カラムにかけるようにと言われました．これもまたカラムが倍必要になるので避けたいです． ちなみに目的は，RT-PCRで発現の半定量をするつもりです．よろしくお願いします．

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