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有り難うございます 削除/引用 No.166-8 - 2007/09/10 (月) 09:07:36 - cognac 通りすがりさん、Bostonさん、expressonさん、お返事有り難うございました。 皆さんのご回答で、はっきりしました。成程、ATGの上流の配列の方がかなり効いているのですね。 今回発現させるタンパク質はN末にターゲットシーケンスが付いているので、迂闊にコドンを変えることは望ましくないと思っていました（アミノ酸一つぐらいならとも考えましたが）。 皆さんのご経験を聞いて、安心しました。cDNAの配列のままやってみようと思います。この後、real-time, westernでちゃんと発現量が上がっていることを、チェックする予定でおります。 皆様のアドバイス、感謝致します。

(無題) 削除/引用 No.166-7 - 2007/09/09 (日) 12:31:57 - expression kozak配列自体が絶対に守らないといけないルールという訳ではないので ATGの後ろがCでも全く問題ないですよ。 私も色々な遺伝子発現をして来ましたが、ATGの後ろがCでもTでも発現しました。 ATG後ろのkozak配列を律儀に守ることによるアミノ酸置換の方が 後々の実験に影響があるかも知れないと思います（どんな実験かにもよるでしょうが）。 なので、ATGの後ろを気にするよりはATGの上流kozak配列を気にした方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.166-6 - 2007/09/09 (日) 10:18:52 - Boston 私は馬鹿の一つ覚えで、NcoI site を PCR primer に組み込んでコンストラクションしています。

(無題) 削除/引用 No.166-5 - 2007/09/08 (土) 20:50:37 - 通りすがり 結論から言うと強制発現させたりするときの場合 ATGの後ろをプリンにしたりするかどうかは それほど気にすることはないです。 Kozak配列は厳密にいうと実験的にはATGの前の6塩基、 特に-3の位置のプリンが最も影響が強く、 もしもピリミジンの場合最大で1/20程度になりますが ATGの後ろの塩基(+4)の場合は 翻訳効率は最大でも1/2程度の変化しかおきないといわれてるので それほど重要かどうかがはっきりしてません。 もしも2倍程度の発現量がcriticalな実験系ならば考慮すべきポイントですが そこまで厳密な系をたてることはめったにないでしょう。 自分の経験でも同様の場合 無理にアミノ酸を変化させたり挿入したりしてませんが 特に問題を感じたことはありません。 そもそもいろんな内在性のタンパクのORFを調べてみればすぐ気が付きますがATGの次がプリンでないものも30%ぐらいありますが 細胞内できちんと発現してるので、 絶対に要求されるべき要因ではないことも明らかですよね。

Kozak配列のATGの後の塩基 削除/引用 No.166-1 - 2007/09/08 (土) 19:00:57 - cognac いつも拝見させて頂いております。 今回、ある遺伝子をpcDNAに組み込み、ヒト細胞で強制発現させることになりました。 遺伝子の効率の良い発現を起こさせる為に、Kozak配列を最初のATGにかかるように設計しようとしておりますが、ATGの後がcDNA配列ではピリミジンのCになっています。その場所はプリンA/Gでなくてはいけないと教わりましたが、プリンにするとアミノ酸が変わってしまいます。このような場合、皆さんどのようにされているのでしょうか？やはりそのままだと翻訳効率は落ちますか？ 過去にも同様な質問もあったように思いますが、もっと詳しく教えて下さらないでしょうか？ どうぞご教授を宜しくお願い致します。

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