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(無題) 削除/引用 No.1658-13 - 2008/08/04 (月) 08:45:23 - 通りすがり スレを立ち上げたものですが、 ターゲティングを行う場合には、私の場合ノックアウト作製用のバックボーンベクターをあらかじめ作製しておき、ポジティブセレクションマーカーとは逆側のMCSの外側にNotI siteを入れておきました。 今まで作製したノックアウトマウスはすべてこのNotIで直鎖にしておりましたが、特に不都合なことは一度もありません。 エンドトキシンに関して、 多くの皆様からご返答頂きありがとうございました。 結局、S.N.A.Pのミニプレップキットを使ってみることにしました。

(無題) 削除/引用 No.1658-12 - 2008/07/31 (木) 17:20:50 - onso9 横レスすみません。 >[Re:11] おおさんは書きました : ホモロガスリコンビネーションとか特殊なことを考えているようであれば、場所は重要なファクターです。 ということですが、具体的にどの場所にするべきなのでしょうか？ 私はES細胞のターゲッティングを行っているので是非教えていただきたいと思います。 今まで何回か行いましたが、意識してcutする場所を決めていなかったもので・・・

(無題) 削除/引用 No.1658-11 - 2008/07/31 (木) 13:34:00 - おお >[Re:9] リポさんは書きました : > 直鎖にするときの切断部位はどこに設定するのかは何かルールがあるのですか？ 単に発現すれば良いと考えているのであれば、目的の発現ユニットが途切れないようになっていればいいと思います。ホモロガスリコンビネーションとか特殊なことを考えているようであれば、場所は重要なファクターです。 前者の場合は特に上述以外に一般的な法則はないと思えます。例えばAmpの中にあるScaIやXmnIはAmpをマンマリアンで必要としませんので、その他の場所で切れるところがなければあまり考える必要なく選択できると思います。ただし、ハツゲンユニットに直接関係してないバックボーンがその発現を助けて、そのため高い発現が得られるプラスミドも幾らかありそうに思えますので、そうなるとますますどこがいいか分からなくなりますね。

(無題) 削除/引用 No.1658-10 - 2008/07/30 (水) 17:10:37 - ~ >[Re:9] リポさんは書きました : > 直鎖にするときの切断部位はどこに設定するのかは何かルールがあるのですか？ プロモーターとORF（とpolyA付加サイト）のユニットは切らないというのはルールですかね。 これを守っていない人はいないと思います。 後は安くてよく切れる酵素を使おうとしているのですが、 MCSにある酵素を使うと上記のルールを破ってしまうので、 それほどいい酵素は使えていません。 ベクターやORFによりますが、pUCori中のApaLIを使うことが多いです。

度々すみません。 削除/引用 No.1658-9 - 2008/07/30 (水) 16:31:39 - リポ 直鎖にするときの切断部位はどこに設定するのかは何かルールがあるのですか？

(無題) 削除/引用 No.1658-8 - 2008/07/30 (水) 15:42:19 - ~ >[Re:5] リポさんは書きました : > 申し訳ないのですが、自分は細胞へtransfectionするときにvectorを環状のまま入れていました。 > 直鎖にする方が導入効率がいいのですか？ 私が前に比べたときは、導入効率はそれほど変わりませんでした。 (transientで90%以上だったので、気にするほど違いが分かりませんでした) ただ、取れてくるシングルクローンの発現量がWBで見て2,3倍は高かったので、 ゲノムにインテグレートされる比率が高くなるのだと思います。 (またはまとめてインテグレートされるようになる？)

(無題) 削除/引用 No.1658-6 - 2008/07/30 (水) 15:13:55 - おお 特にミニプレップ目的のやつは、物によってはLPSなどが濃縮されてダメとあるメーカーがいっていたときいたことがあります。直接聞いた話ではないのでどこまで信用性があるかわかりませんが、、、

横槍で 削除/引用 No.1658-5 - 2008/07/30 (水) 15:08:05 - リポ 申し訳ないのですが、自分は細胞へtransfectionするときにvectorを環状のまま入れていました。 直鎖にする方が導入効率がいいのですか？

(無題) 削除/引用 No.1658-4 - 2008/07/30 (水) 09:47:31 - ~ PEG沈でもHeLaや293Tには入りましたけどね。 エンドトキシンフリー用ではないQIAGEN Plasmid Midi Kit、QIAGEN Plasmid Maxi Kitで、293T,HL60などに入れていました。 また、シングルクローンやある程度の頻度で入ったマスカルチャーを得ようとしている場合と、 ライブラリーなので多少の出費が増えても形質転換頻度をあげたいという場合でも 何がいいのかは変わってくると思います。 細胞によってエンドトキシンへの感受性は違うでしょうし、 精製方法の条件検討をするよりも、あまり考えずにエンドトキシンフリーのカラムを使って、 別の部分に時間をかけた方が効率的だと思います。 ただ、手持ちのカラム＋エタ沈で入れば一番早いでしょうから、 一度やってみてから購入を検討しても遅くは無いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1658-3 - 2008/07/30 (水) 05:18:40 - おお エンドトキシンフリーをうたっていないキットは物によってはDNAと一緒に非常に濃縮されてエンドトキシンが溶出するようなものもあるようです。 キットの特性などをまとめた表がモレキュラークローニングにあったと思います。１度目を通してみればどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1658-2 - 2008/07/30 (水) 03:55:38 - おお >[Re:1] 通りすがりさんは書きました : > どうせ直鎖にするために制限酵素で消化した後にエタ沈で精製するので、特にミニプレップはエンドトキシンフリーじゃなくても良いかな？と思っています。 > よろしくお願い致します。 エタチンやフェノクロではLPSとか効率よく除けません。手前味噌でやるのであればTRITONーX114を使う除去方法がいいかと思います。 PEGなどでプラスミドに混在する物を除去して、毒性を下げれるのですが、これも限界があるように思えます。感受性の強い細胞にはあまり効果がありません。個人的には6Mウレア存在下でエタチンして可也混在する毒性を減らすことができてますが、具体的に何がどのように減っているのかという点では検証したことがありませんので、それでいいかどうかは個々に判断をゆだねます。

リポフェクションの際のエンドトキシンに関して 削除/引用 No.1658-1 - 2008/07/29 (火) 19:00:20 - 通りすがり トランスフェクション初心者です。 今度、安定発現株の作製を行うのですが、導入するプラスミドのミニプレップはエンドトキシンフリーのものの方が良いのでしょうか？ どうせ直鎖にするために制限酵素で消化した後にエタ沈で精製するので、特にミニプレップはエンドトキシンフリーじゃなくても良いかな？と思っています。 よろしくお願い致します。

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