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ありがとうございます。 削除/引用 No.1653-14 - 2008/08/04 (月) 09:38:40 - すみれん 皆様 お忙しいところ御返事いただき、ありがとうございます。 また、出張とは言え、返事が遅れて申し訳ありませんでした。 EcoRI 様 受託で作製した抗体ですが、WBをやってみようと思います。 アルブミンとかが邪魔になりそうですが・・・。 通りすがり　様 血漿はヘパリン血になります。今後、EDTA、血清で 確認してみます。問題はこれまで保存していたサンプルが ヘパリン血という事です。。。。

(無題) 削除/引用 No.1653-13 - 2008/07/31 (木) 16:38:54 - 通りすがり 血漿作製に使用する抗凝固剤はヘパリンですか？ ヘパリン使っていると測定できないELISA Kitを扱かったことがあります。 ご自身がお使いの抗凝固剤とコンパチブルか確認することをお勧めします。 ちなみに、ヘパリンが使えないやつはEDTAが推奨されていたものが多かったです。

(無題) 削除/引用 No.1653-12 - 2008/07/30 (水) 11:31:54 - EcoRI 抗体が非特異的に反応しているかどうかは、血漿をWBしてみればわかるかと思います。 用いられている抗体がWBに対応しているかどうかわかりませんが、 対応しているならば、やってみる価値はあると思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1653-11 - 2008/07/30 (水) 11:11:18 - すみれん 皆様 お忙しいところアドバイスありがとうございます。 とても参考になり、勉強になっています。 他の仕事があり、現在ELISAは止まっています。 （ので、皆さんのコメント大変助かります。） ~様 コントロール用のホルモンを添加するというのは 考えてもいませんでした。直ぐにやってみようと思います。 目的ホルモンの日内変動などを見たいのでできればELISAで 測定したいのが本当のところです。 himawari様 希釈したサンプルは濃度の低い値で数値が変わらないままです。 と、なると、濃縮して測定の方が良いのかと思ったりしますが、 論文などで出ている他動物の濃度からすると値がずれてしまいます。 妨害物質は単純にフィブリンとか、と思うのですが確証はありません。 抗体や抗原の希釈に使用するbufferはCan get signalなのですが、 血漿の希釈を含めてやや良かったbufferは市販測定キットに付属していた bufferでした（但し、そのキットでは種が合わず測定不能）。 ・・・・何が入っているのだろう。。。 EcoRI様 濃縮に関して変性が起こるというのは余り考えていませんでした。 なかなか難しいことが分かりました。

(無題) 削除/引用 No.1653-10 - 2008/07/30 (水) 09:57:46 - EcoRI 何を書いているんだ、私は… 直下の私のコメントは無視してください。 シグナルがないのに希釈しても意味がないですね 大事なことを忘れていました 一般的に、有機溶媒やTCAなどで濃縮操作をすると、タンパク質の変性が起きるものと考えていいです。 ですから、濃縮操作を行った後でELISAを行うと、まったく検出できないかもしれません。 - ~さんがおっしゃるように、WBで定量してみる方がいいかもしれません。 WBならば、変性は影響しませんから。

(無題) 削除/引用 No.1653-9 - 2008/07/29 (火) 18:05:40 - EcoRI >どちらかというとシグナルがないまま倍々希釈をしていっても >変化がない、という感じです。 抗体の感度がいいために、検出の上限を超えてしまっているように思えます。 希釈を２倍系列から、５倍もしくは１０倍に変えて、 よく変化がでる希釈倍数を求めてみてはいかがでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1653-8 - 2008/07/29 (火) 17:52:36 - himawari もう少し詳しい状態を知りたいです。 希釈したサンプルはELISAの検出限界以下なのか、測定を妨害するような物質が血漿中に存在するのかなど。 一通りのホルモンのELISAをやったことがありますが、系によっては妨害物質により測定に影響を与えることがありますので、限外ろ過をすることもあります。しかしながらほとんどは希釈するかそのまま血清を使うはずです。

(無題) 削除/引用 No.1653-7 - 2008/07/29 (火) 16:55:16 - ~ 手持ちの血液サンプルを測定してみる際に、 コントロール用のホルモンを添加して、 添加回収できるかどうかも見てみてはいかがでしょうか？ サンプル数にもよりますが、WBできるのであれば、 精製時の収率なども気にしなくてすむので、 WBだけで済ませてしまうほうが楽かもしれません。

ありがとうございました。 削除/引用 No.1653-6 - 2008/07/29 (火) 15:38:00 - すみれん EcoRI 様 ~　様 御返事ありがとうございます。 EcoRI　様 ウェスタンで確かめるという発想はありませんでした。 いずれやらなければならないので準備を始めたいと思います。 ~　様 目的のタンパク質の濃度は数μg/mlと予想され、 100-200倍希釈であればELISAの感度は大丈夫なはずです。 どちらかというとシグナルがないまま倍々希釈をしていっても 変化がない、という感じです。 もし、アルブミン、グロブリンなどが問題であれば 血清、或いはEDTA血漿でも測定できない事になりそうです。 それら血液で測定できるか試してみます。 （これまでストックしてあるのがヘパリン血なのが・・・） うまい処理方法があるとよいのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.1653-5 - 2008/07/29 (火) 12:03:54 - ~ 問題が濃度が薄いだけならば、濃縮だけで測れるようになるでしょうけれども、 アルブミンやグロブリンなどが非特異に反応しているのであれば、それらを除く必要があるかもしれませんね。 測れていないのは、シグナルが無い(検出限界以下)なのですか？ それとも、全てのサンプルで高い濃度になってしまっているのですか？ サイズがアルブミンなどよりも十分違っていれば、 限外ろ過でアルブミンなどと分けてから、スピードバックなどで濃縮できませんかね。

(無題) 削除/引用 No.1653-4 - 2008/07/29 (火) 10:45:59 - EcoRI >一方で、沈殿ではなく、上清を乾固させて処理するという >記述もあり、目的のペプチドホルモンがどちらにあるのか >混乱しています。 なるほど… 真空乾燥機か何かで上清から溶媒を取り除くわけですか ならば、目的のモノがどちらにあるのかは、 western blotで確かめるしかないと思います。 anti-アルブミンカラム、anti-Igカラムなどを通して、 メジャーなタンパク質を除いてみる というのも手かと思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1653-3 - 2008/07/29 (火) 09:04:34 - すみれん 早速の御返事ありがとうございました。 また、説明が不足して申し訳ありません。 EcoRIさんの仰るとおり、沈殿を処理するのであれば 濃縮のように思います。 一方で、沈殿ではなく、上清を乾固させて処理するという 記述もあり、目的のペプチドホルモンがどちらにあるのか 混乱しています。

(無題) 削除/引用 No.1653-2 - 2008/07/28 (月) 18:19:14 - EcoRI おっしゃる処理は除タンパクではなく、濃縮ではないでしょうか？

ELISAに使用する血漿・血清の除タンパクについて 削除/引用 No.1653-1 - 2008/07/28 (月) 17:06:38 - すみれん 初めて質問させていただきます。 現在、血漿中のペプチドホルモンをELISAで測定しようとしています。 これまでのところ、スタンダードはうまく描けそうですが、 血漿の希釈したサンプルではうまくいきません。 何とか測定できる処理を、と思い、調べたところ アセトンやアセトニトリルによる除タンパクが良さそうに思いました。 この処理の中で遠心後の沈殿では無く、上清を乾固させて bufferに希釈するようなのですが、 除タンパクというからには目的の物質は沈殿物の方に あるのではないのでしょうか。 目的のホルモンの分子量によって使用するアセトン等の 量を変更するのでしょうか。 また、ELISAに適する血漿の適切な処理は御存知ありませんでしょうか。 素人のような質問で申し訳ありませんがよろしくお願いいたします。

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