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単純な事を聞いて申し訳ないですが･･･ 削除/引用 No.1648-11 - 2008/08/05 (火) 19:14:54 - Ex コンストラクトのシーケンスをきちんとチェックしましたか？ 一応、制限酵素処理も。 目的としているタンパク質が分泌されるものなら、もともとのシグナル配列を除去して、αファクターを連結しますし、 分泌されないものなら、単純にαファクターを連結しました。

(無題) 削除/引用 No.1648-10 - 2008/07/30 (水) 19:22:42 - A atsさん > 拙著です（身元がバレますが）。Gene Ther. 2003 May;10(9):781-8 > 引用していただけると幸いです。 情報有難うございます。今更ですがレファレンスだけ示して さらっと流して頂いて問題なかったような。

(無題) 削除/引用 No.1648-9 - 2008/07/30 (水) 16:27:17 - ats >[Re:8] Aさんは書きました : > 横レスですがこのアイデアはどのようにして見つけられたのですか？ 拙著です（身元がバレますが）。Gene Ther. 2003 May;10(9):781-8 引用していただけると幸いです。 醤油や味噌中でも増える奴がいるのだからという単純な発想です。

(無題) 削除/引用 No.1648-8 - 2008/07/30 (水) 15:51:53 - A atsさん > このときは、0.5M(1M)のNaClを培地に添加すると、培地中に完全長のタンパクが分泌されました。 > 理由は、高塩濃度環境で菌体外プロテアーゼが阻害された and/or シャペロンが誘導されたのではないかと考えています。 > ただし、菌のNaClへのadaptationが必要でした。通常寒天培地＞＋0.25M NaCl>＋0.5M NaClと植え継ぎました。 > ご参考になれば。 横レスですがこのアイデアはどのようにして見つけられたのですか？ 私もある蛋白質をPichiaで発現させると半分ぐらい分解されたフラグメント が出てきてしまうのでチャンスがあれば試したいと思うのですが、論文 などのリファレンスはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.1648-7 - 2008/07/30 (水) 11:49:54 - ats >[Re:6] ことねさんは書きました : > atsさん＞ > ＞Ste13切断配列(Glu-Ala)をさらに余分に2つほど増やしても効果があるかもしれません。 > 切断配列を余分につけることで > シグナルペプチドと目的タンパクの距離を少しでも離すことができ、 > 切断の可能性も増えるので良いかもしれません。 経験はありません。何かで読んで（と思う）新たにトラブったときに試してみようとかすかな記憶がありましたので書き込みました。参考程度にしてください。理屈はことねさんが書かれていることと同じです。

(無題) 削除/引用 No.1648-6 - 2008/07/28 (月) 20:19:11 - ことね atsさん＞ ご回答ありがとうございました。 高塩濃度培養を行い、菌体外プロテアーゼを阻害するという考えは 思いつきませんでした。 参考にさせていただきます。 ＞Ste13切断配列(Glu-Ala)をさらに余分に2つほど増やしても効果があるかもしれません。 これは、atsさんの経験談ですか？ もしそういうご経験がありましたら教えいただけると嬉しいです。 切断配列を余分につけることで シグナルペプチドと目的タンパクの距離を少しでも離すことができ、 切断の可能性も増えるので良いかもしれません。 いろいろアドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1648-5 - 2008/07/28 (月) 16:44:15 - ことね おおさん＞ ご回答ありがとうございます。 今回、発現させようとしているタンパク質は、 COS-1細胞で発現させると、培養上清に分泌することが分かっています。 今回は、大量に目的のタンパクを抽出したいためPichiaを用いています。 ＞分泌されるタンパクはもともと、シグナルペプチドかそれ様の配列があり＞ますが、そのまえに分泌シグナルをつけることによって、シグナルペプチ＞ドが、疎水的でヘリックす構造を持つためそれを介して膜に結合してしま＞っているとか。 なるほど、勉強になります。 今回はPichia用ベクターのalpha-factorのシグナル配列の後に 目的のタンパクのmatureな配列を連結させて発現を試みていますので、 ちょっと状況が違うかもしれませんが、 そのようなことが起こっているかもしれません。 おりがとうございました。

シグナル配列 削除/引用 No.1648-4 - 2008/07/28 (月) 12:35:12 - ats pPICZ alphaだと、alpha-factorのpre-proの分泌シグナル配列を利用していると思いますが、Ste13切断配列(Glu-Ala)をさらに余分に2つほど増やしても効果があるかもしれません。 シグナルペプチドの切断は、連結したタンパクのN末端配列に影響されることがあるらしいです。 N末にFlagタグなどを導入し、シグナルペプチドと目的タンパクの距離を離してみるのも良いでしょう。N末C末にタグがあると完全長タンパクであることが確認できて便利なときがあります。

高塩濃度培養 削除/引用 No.1648-3 - 2008/07/28 (月) 12:22:53 - ats C末に荷電性の強いタグを付けて組換えscFv抗体（40-50kDa)を発現させたことがあります(Gene Ther. 2003 May;10(9):781-8)。 このときは、0.5M(1M)のNaClを培地に添加すると、培地中に完全長のタンパクが分泌されました。 理由は、高塩濃度環境で菌体外プロテアーゼが阻害された and/or シャペロンが誘導されたのではないかと考えています。 ただし、菌のNaClへのadaptationが必要でした。通常寒天培地＞＋0.25M NaCl>＋0.5M NaClと植え継ぎました。 ご参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.1648-2 - 2008/07/27 (日) 01:00:34 - おお このシステムに関して経験はないのですが、、、 もともと分泌されるたんぱく質でしょうか? 膜につきささっているのかなというふうにもそうぞうできますが、、、 例えば分泌されるタンパクはもともと、シグナルペプチドかそれ様の配列がありますが、そのまえに分泌シグナルをつけることによって、シグナルペプチドが、疎水的でヘリックす構造を持つためそれを介して膜に結合してしまっているとか。 想像の範囲で回答させていただきました。

Pichiaでのタンパク質発現について 削除/引用 No.1648-1 - 2008/07/26 (土) 20:53:03 - ことね いつも勉強させていただいています。 最近タンパク関係の研究を始めたばかりなので アドバイスをいただきたいと思い投稿してみました。 問題点というのは 外分泌系のベクターを用いているにもかかわらず 発現させたタンパク質が菌体内には発現しているのに、 培地には分泌されていないことです。 詳細は以下です。 Pichia GS115株を用いてヒトのあるタンパク質（約100kDa） を産生しようとしています。 ベクターは、pPICZ alphaを使っています。 まず、小スケールで発現を確認しようと思い、 BMGY培地2mlで前培養を24-48hr行い、 OD600=1となるようにBMMY培地にうつし、24hrごとに0.5% MeOHを加え 発現を誘導しました。 そして、96hr,120hr後に培地をサンプリングし western blotにて発現を確認しましたが、バンドは検出されませんでした。 その後、菌体をSDS-PAGEサンプルバッファで懸濁し、 western blotを行ったところバンドが検出できました。 菌体内に発現したタンパク質を培地に分泌させる方法をご存知の方や そのような経験のある方がいらっしゃいましたら アドバイスいただければ幸いです。 初心者なもので初歩的なミスをしているかもしれないので どんな指摘でもお願いします。 よろしくお願いします。

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