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レポーターコンストラクト トピック削除
No.164-TOPIC - 2007/09/08 (土) 04:40:12 - ベクター
レポーターコンストラクトをpromegaのPGL４を用いて作成しようと考えているのです。このベクターのルシフェラーゼのATGの直前の領域はおそらくリボゾーム結合部位を含んでいると想像していて、そのさらに上流にクローニングサイトがあります。
例えば、このベクターのクローニングサイトに入れようとしているフラグメントは、プロモーター領域、転写開始点、非翻訳領域、翻訳開始点、コーディング領域の一部、引き続くイントロンの一部を含んでいます。このとき、クローニングしようとしているフラグメントの中に含まれているリボゾーム結合部位、ATG, エクソンーイントロンのジャンクションの存在は、本来のルシフェラーゼの発現には影響を与えないのですか。もしくはこのようなコンストラクとは正しくないのですか．ご教授ください。
　
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(無題) 削除/引用
No.164-5 - 2007/09/19 (水) 10:54:41 - ベクター
教えて頂いた文献を元に、スプライシングのサイトを入れたコンストラクトも作ってみる事にしました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.164-4 - 2007/09/16 (日) 09:43:44 - ats
> 今、最も気にしているのは（２）の場合です。２つのATGが存在する場合、どれほどお互いからの発現がでてくるのか。
うろ覚えなのですが、最初のATGからの翻訳効率が高い場合は、2つのATGからはほとんど翻訳されないようです。ribosomeがCAPsiteから5'->3'方向にscanしているからという説明です。

> ところで、もう一つ質問ですが、２つの翻訳開始点があり、その両方が、リボゾーム結合部を持っている場合、最初のATGのAをGにかえるだけで、リボゾーム結合部位は除く必要はないのでしょうか。
mRNAの高次構造？を変えないようにできるだけ変異導入はさけるべきだと思います。その理由からリボゾーム結合部位は除かないほうがよいでしょう。

２つのATG 削除/引用
No.164-3 - 2007/09/10 (月) 23:25:37 - ベクター
早速のご返事ありがとうございます。
目的は、ご指摘の通り、その両方にあります。(1)の可能性は否定できませんが、これは、起きない事を願っています。必要であれば、エクソンーイントロン部分の配列を変えて対応しようと思っていますが。
今、最も気にしているのは（２）の場合です。２つのATGが存在する場合、どれほどお互いからの発現がでてくるのか。たとえ、弱くても、ルシフェラーゼからの発現が見られれば何とかなるのかとも考えていますが。
ところで、もう一つ質問ですが、２つの翻訳開始点があり、その両方が、リボゾーム結合部を持っている場合、最初のATGのAをGにかえるだけで、リボゾーム結合部位は除く必要はないのでしょうか。

BBRC読ませて頂きました。理想的ですね。

(無題) 削除/引用
No.164-2 - 2007/09/08 (土) 12:35:41 - ats
実験の目的が発現制御領域を探すのか、刺激等で変化がみられるかを検討するのか等、不明ですが、とりあえず、そのまま組み込んでみましょう。ただし、ご心配の理由でルシフェラ−ゼ活性は低いと思います。intronを入れない方が簡単なのですが、いろいろと制御配列がありますからね。
そのままの配列でうまく行かない（活性が低すぎて測定できない）場合は、いくつかの変更を加える必要があります。しかし、その変更がmRNAの代謝（安定性など）に影響が出る可能性もありますので注意が必要です。
ルシフェラ−ゼ活性は低くなる理由として二つ考えられますので、どちらか、あるいは両方の変更が必要かもしれません。
(1)PGL４はintron-lessですが、cryptic splicing acceptor配列により、ルシフェラ−ゼ遺伝子部分を（一部）飛ばしたmRNAが生じる可能性。これを克服するためには、人工もしくは、目的遺伝子のsplicing acceptor配列をルシフェラ−ゼ遺伝子の5'部位に組み込む必要があります。
(2)目的遺伝子の翻訳開始点から翻訳されてしまい、ルシフェラ−ゼ遺伝子が翻訳されない可能性。これを克服するためには、読み枠を合わせてルシフェラ−ゼ遺伝子との融合遺伝子にしてしまうのも一つの方法です。
または、目的遺伝子の翻訳開始点(ATG)をGTGに変更し、翻訳開始されないようにする方法。ただし、この変更はmRNAの高次構造に影響が出て二次的な効果が生じる可能性があります。そのため、この場合も読み枠を合わせておいて、ATG-typeとGTG-typeでルシフェラ−ゼ活性の絶対値は変わっても刺激応答などに変化がないことを確認した方がよいでしょう。
拙著（BBRC (2001),286:863−868）が、参考になれば幸いです。

レポーターコンストラクト 削除/引用
No.164-1 - 2007/09/08 (土) 04:40:12 - ベクター
レポーターコンストラクトをpromegaのPGL４を用いて作成しようと考えているのです。このベクターのルシフェラーゼのATGの直前の領域はおそらくリボゾーム結合部位を含んでいると想像していて、そのさらに上流にクローニングサイトがあります。
例えば、このベクターのクローニングサイトに入れようとしているフラグメントは、プロモーター領域、転写開始点、非翻訳領域、翻訳開始点、コーディング領域の一部、引き続くイントロンの一部を含んでいます。このとき、クローニングしようとしているフラグメントの中に含まれているリボゾーム結合部位、ATG, エクソンーイントロンのジャンクションの存在は、本来のルシフェラーゼの発現には影響を与えないのですか。もしくはこのようなコンストラクとは正しくないのですか．ご教授ください。
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