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(無題) 削除/引用 No.1603-12 - 2008/07/29 (火) 09:41:23 - よっしー > あと1点、脾臓細胞は前任者に浮遊さいぼうだと教えられておりましたが > 実際に抽出する時にピペットマンで細胞とメディウムを集めて、その後WELLをのぞいてみると細胞が結構底に固着して残存しています。 脾臓細胞ってどんな細胞が含まれていますか？ その辺りを考えるとわかると思いますが． まずどちらの細胞を見たいのかが重要だと思います．

(無題) 削除/引用 No.1603-11 - 2008/07/29 (火) 08:27:26 - 刺激的 大変参考になりました。ありがとうございます。 あと1点、脾臓細胞は前任者に浮遊さいぼうだと教えられておりましたが 実際に抽出する時にピペットマンで細胞とメディウムを集めて、その後WELLをのぞいてみると細胞が結構底に固着して残存しています。そのためスクレイバーでそこをこそいでいましたが、そもそも脾臓細胞はほんとに浮遊細胞なのでしょうか。そうであっても十分に回収できてないようなら回収時にトリプシン処理などしたほうがよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1603-10 - 2008/07/27 (日) 02:06:47 - 免疫PD >私は現在RNA用には2×10*6で6WELLで6-8時間、ELISA用には２×10*5で96WELｌ >で16-24時間刺激で行ってますがこれについては問題があるでしょうか。 mRNA発現確認には数時間で充分ですが，ELISAにて検出するためにはサイトカインの蓄積を要求するため24時間以内では感度的に厳しい場合が多いです． 2x10^5/wellはwellあたりの細胞数としては妥当ですが，24時間以内にサイトカインの検出を試みる場合には心もとないですね．私の場合は，同じ細胞数で通常48h，タイムコースを見るために24-72hの間で数点確認する形をとっています．

参考までに 削除/引用 No.1603-9 - 2008/07/26 (土) 20:41:38 - KIO PMA+Ionomycin刺激の機序ですが PMAはdiacylglycerolの代わりとしてprotein kinase Cを活性化し Ionomycinは細胞内カルシウム濃度を上昇させます。 以上のことはT cell receptorを刺激した際に起きることであるため PMA+Ionomycin刺激はT cell receptor刺激の代わりとして用います。 通常、抗体でT cell receptorを刺激した場合より遥かに強い効果をもたらし、サイトカインの発現などが顕著に見られます。 自分の場合 PMA 50ng/ml + ionomycin 1 uM で行っています。サイトカイン発現は６時間で検出できます。 注）カルシウムイオノファにはionomycin以外にA23187がありますが後者では細胞毒性が強いようでうまくT細胞を活性化することはできませんでした。 参考までに。

(無題) 削除/引用 No.1603-8 - 2008/07/26 (土) 20:17:57 - 刺戟的 みなさま色々とご意見たいへんありがとうございます。 細胞の取り扱いがまだ熟練しておりませんのでやはり手技的な問題が大きいのかと自分でも感じております。参考に教えていただきたいのですがPMA、IOの濃度は大体どのくらいで行っているのでしょうか？ 私は現在RNA用には2×10*6で6WELLで6-8時間、ELISA用には２×10*5で96WELｌで16-24時間刺激で行ってますがこれについては問題があるでしょうか。 免疫PDさんにご指摘いただいたようにOVAとAlumにてアレルギーモデルを作成して同じようにしてみるつもりではありました。PMA/Ioでまずは刺激してみようと思ってますが、アレルギーモデルならばOVAによる抗原刺激でもよいのかなと考えています。他の論文では3，4日刺激を加えるようなのですがやはりこれくらいは必要なのでしょうか。 長くなり申し訳ありませんがよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1603-7 - 2008/07/26 (土) 17:40:05 - りょう 免疫PDさんの意見とかぶりますが、 僕も細胞調製時の問題(細胞が弱っている？）、P/I刺激の仕方（濃度・時間など）が悪くて死にかけている？、細胞密度（高い方が弱らないだろうし、サイトカインの検出効率も高まるでしょう）などの問題が考えられると思いいます。 ブラスト化していたのかどうかなど、イマイチ状況が見えないですね。

(無題) 削除/引用 No.1603-6 - 2008/07/26 (土) 12:57:46 - 免疫PD まずP/I刺激にて細胞の増殖や活性化は認められましたか？ きちんと増殖や表面マーカーを見なくとも，コロニーの形成や細胞の様子を顕微鏡下で確認するだけで刺激の入り具合はわかります．いかがでしょうか． 細胞の様子に変化がなければP/Iあるいは手技的に問題があったと考えられます． 細胞の様子に変化があっても当該サイトカインの産生が認められなかった場合には，感度の問題が考えられますね．P/I刺激は当該サイトカインを誘導するのに充分な刺激です（数えきれないほどの論文があると思います）が，ご本人も危惧されているように主としてTh2の存在頻度に依存するサイトカイン群ですから，FreshなSplenocytesでは産生量が測定には充分ではなかったのかもしれません（Purified Tを用いた場合には当該サイトカインは問題なく検出可能だったと記憶していますが，脾臓細胞だと感度的に苦しいのかもしれません）． ではどうすればよいか． T細胞を分離できるに越した事はありませんが，次善の策としては次のような形が考えられるかもしれません． -脾臓細胞からTh2を誘導し，それをソースとする．IL-4とanti-IFNgがあれば脾臓細胞からスタートしてもある程度のTh2を得ることができます（FACSがなくてもELISAでTh2の確認はできるでしょうし）． -マウス（Balb/c等）をAlum等をアジュバントとして免疫し，その脾臓やリンパ節をソースとして用いる． など． しかし，個人的な感想としては，IFNgすら検出できなかったようですので，P/Iあるいは手技的な問題の可能性が非常に高いと感じています． なんらかの参考になれば幸いです．

(無題) 削除/引用 No.1603-5 - 2008/07/23 (水) 03:38:23 - ぽすど君 >[Re:4] amiさんは書きました : > > 今回はIL-5、IL-13またIFN-γなど > > IL-5、IL-13はPMA/イオノマイシンで分泌されるという報告はあるのですか。 > 僕は無知なんでなんとも言えませんけどそういう報告は見たことないです。 産生細胞がいれば普通に産生されます。

(無題) 削除/引用 No.1603-4 - 2008/07/22 (火) 23:34:26 - ami > 今回はIL-5、IL-13またIFN-γなど IL-5、IL-13はPMA/イオノマイシンで分泌されるという報告はあるのですか。 僕は無知なんでなんとも言えませんけどそういう報告は見たことないです。

(無題) 削除/引用 No.1603-3 - 2008/07/21 (月) 23:12:04 - 刺戟的 前回はかなり昔のことです。目的のサイトカインも別物でした。 情報があいまいですいません。今回はIL-5、IL-13またIFN-γなどのアレルギーに関与したサイトカインを目的としています。マウスの脾臓細胞です。 本当はTｈ２などでしたらよいのでしょうが、脾臓から単離したりフローサイトをおこなったりできる技術がありませんので脾臓細胞全体で検討しています。

(無題) 削除/引用 No.1603-2 - 2008/07/21 (月) 19:42:36 - ami ０）前回は同様の刺激で目的のサイトカインが出たのですか １）マウスですか、Humanですか ２）目的のサイトカインは何ですか ３）脾臓細胞全体をターゲットにしないといけないのですか、特定のサブセットではだめですか

脾臓細胞での刺激薬の選択について 削除/引用 No.1603-1 - 2008/07/21 (月) 18:06:47 - 刺激的 いつも参考にさせていただいております。 脾臓細胞からのサイトカイン産生および薬剤の抑制効果の検討をELISAとRT=PCRで行おうと考えております。 我々の研究室では以前にPMA・カルシウムイオノフォアで刺激を行っておりましたが、今回同様の刺激を加えても目的のアレルギーに関与するサイトカインが検出できませんでした。 PMA・カルシウムイオノフォアがサイトカイン産生の刺激となるメカニズムを私自身よく理解しておらず、実験手技の問題なのかそれ以外なのか悩んでおります。よくご存じの方がおられましたら教えてください。 またそれ以外に何か適した刺激薬をご存知でしたら教えてください。

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