全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1582-14 - 2008/07/18 (金) 14:41:29 - 困り者 ＞田舎者様 なるほど。勉強になります。 一度プロテオミクスを専門にする方に実際のところを聞いてみるのがいいですかね。 少しあたってみることにします。 お忙しい中ありがとうございました。

追加 削除/引用 No.1582-13 - 2008/07/18 (金) 14:19:23 - 田舎者 お聞きいただいたことに答えていませんでした。すいませんでした。SILACは単なる蛋白質の同定だけでなくさまざまな翻訳後修飾の解析で好んで用いられています。むしろそのための手法と言ってもいいくらいですです。

(無題) 削除/引用 No.1582-12 - 2008/07/18 (金) 13:36:23 - 田舎者 私も専門家でないので具体的な詳細は分かりませんがプロテオミクスの世界では最近最も良く用いられている方法の一つのようです。必ずしもそんなに高度に精製しなくてもきょう雑蛋白質存在下でも多くの有用な情報が得られるというのが強みみたいです。ただ高額な機器と設備が必要ですし実際の分析や結果の解析はそれ相応の能力と経験のある蛋白質質量分析の専門家でないと難しいとおもうので、すでにそうした分析に実績のあるプロテオミクス分野のラボと共同して必要に応じて分析などお願いするなどして進めるのが現実的と思います。学会などの機会を利用して相談してみたらどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1582-11 - 2008/07/18 (金) 12:15:08 - 困り者 ＞田舎もの様 お返事ありがとうございます。 SILACという方法を僕は知りませんでしたが、おもしろい手法ですね。 私は質量分析を用いて翻訳後修飾の解析を行いたいと考えているのですが、このSILACという手法はそのような解析にも有効なのでしょうか？ もしお知りならば教えていただけたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1582-10 - 2008/07/18 (金) 04:50:26 - 田舎もの もし培養細胞系でかつもしLC/MS/MS持ってるなら（or どこかに頼めるなら）安定同位体標識アミノ酸を使えばどうでしょうか(いわゆるSILAC)。Flag tag-蛋白質を発現させた方と、空ベクターのコントロールの２種類の細胞を用意してそれぞれ異なる安定同位体のアミノ酸(Lys, Argなどよく使われる）で十分な期間培養して細胞内の全蛋白質を標識しておいて、そこから抗Flag 抗体で免疫沈降して精製物を混合して酵素消化、LC/MSで分析するのです。生成した大量のペプチド断片から非特異的なバックグランドの蛋白質由来のペプチドを識別し差し引きできるので、結果として特異的に結合した蛋白質由来のペプチドが分かります。本件のように精製度の低い試料の分析に適しており最近汎用されてます。問題はFlagつけた蛋白質だけでなくこれと強く相互作用する蛋白質もともに精製されていることが考えられるので、それら由来のペプチドも含んでいる可能性です。（これを逆に利用してinteractomeを調べることがむしろおおいですが。）SDSなどで一旦変性させてから希釈して免疫沈降すればこうしたassociated proteinsの問題はかなり回避する事はできます。

(無題) 削除/引用 No.1582-9 - 2008/07/17 (木) 22:20:18 - 困り者 みなさんアドバイスありがとうございます。 私の今の実験の場合、確かにメンブレンを銀染色で染めることももしかしたら可能なのかもしれませんが、実験を進めるにあたってはまず、目的のタンパク質をよりキレイな状態で精製してくるのが必要なのかもしれませんね。 ちなみに、私は現在FLAGタグを用いてアフィニティー精製した後に、二次元電気泳動を行い、目的のタンパク質をとってこようとしているのですが、銀染色だとかなり共雑タンパク質が検出されてしまって、目的のタンパク質がどれだかわからないといった状況に陥ってしまっています。 もちろん、質量分析は変法の銀染色を用いても良いと思うのですが、何かしらこの状況を解決する手立てはないでしょうか？ やはり、目的のタンパク質をより多く精製してくることを考えた方がよいでしょうか？ 質問がかわってしまってすみませんが、よろしくお願いします。

分子量あたりで 削除/引用 No.1582-8 - 2008/07/17 (木) 14:46:51 - ema 私はLC/MSにかけたときはとりあえず近似分子量のところを切り出して、ピークは何本か出ましたが解析でどうにかしました。 うちにもないですが島津のintractMSっていう技術だとメンブレンを銀染してMSにとばしてますね。

(無題) 削除/引用 No.1582-7 - 2008/07/17 (木) 08:33:26 - ami まずは、、やはり免疫沈降かなぁ、、、 あとは、しっかりＷＢがWorkしているなら、何らかの粗分画で分けたらいい結果になる可能性もあるかも、硫安沈殿とか、逆相カラム使うとか

(無題) 削除/引用 No.1582-6 - 2008/07/17 (木) 08:12:07 - 120km ウェスタンができるならだめもとで免沈してみるかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.1582-5 - 2008/07/17 (木) 06:20:11 - 名無し 基本的にゲルで沢山染まるなら膜でもほぼ同じと思うので苦労して膜染めても進展ないとおもうから薦めないというかサンプルがクルードということもあるしもともと相対的な存在量が少ないことが最大のネックと思うので分離だの検出だのうんぬん以前にまずこの点を解決しないとなにも始まらないと思うのでやっぱ膜染めるとかみたく小手先のこといじってもそれはどんなもんでしょうかねといますごいおもった。つまりいらない蛋白質除いてほしいやつを濃縮するということが大事でじゃあそれはどうすればいいかというと、遺伝子いれて強制発現させてるならタグ付けられるとおもうからそれをたよりにアフィニティー精製してenrichmentできるとおもう。でもヒスタグみたくtagによっては全然きれいにならないかもしれないのでそのときはタンデムタグとかをつけて２段階精製すると結構行けるというか前やったらできた。このあたりはコンストラクトの設計段階の工夫の問題。それプラスだけど発現が低いなら（あえて低くしてるなら）作った遺伝子を適当なベクターにうつしてそれでステーブルトランスフェクタント作ってがんがんふやして十分量の出発材料（さいぼー）を確保する必要がある。これはトランジエントだと現実的にはむずかしい。 あとPVDF膜から蛋白質とってきたりとか酵素消化したりとかはマスではたぶんすごい難しいというかいまだ成功した例あまり聞かない。銀染蛋白質もそれやるときに側鎖が修飾とかされるからマスにはあまり向かない気するすごいする。

(無題) 削除/引用 No.1582-4 - 2008/07/17 (木) 05:44:48 - 名無し すいません論文セルロースアセテート膜だった。ニトロセルロース膜とは違うかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.1582-3 - 2008/07/17 (木) 05:42:23 - 名無し ニトロセルロース膜なら銀染論文ある。 Silver stain for proteins on a cellulose acetate membrane. Fujita T , Toda T and Ohashi M Anal Biochem 139, 463-7 1984 出来るかどうか分からないけどPVDFに適用してみれば。

(無題) 削除/引用 No.1582-2 - 2008/07/17 (木) 00:08:25 - A この銀染色のキットを買って使うわけにはいきませんか？ もし出来るのであればゲルを銀染色して切り出すだけのはずです。 http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/713_021258_SlvrQst_bro.pdf 膜の銀染色はしたことありませんが銀染色はとにかくなにか引っかかる ものがあるときに染まりますからwashしたとはいえブロッキングなどを 行った膜は真っ黒に染まるのではないかと想像します。

WB後のメンブレンの銀染色について 削除/引用 No.1582-1 - 2008/07/16 (水) 23:01:51 - 困り者 いつも参考にさせていただいてます。 現在、私はタンパク質の質量分析を行いたいと思い研究に励んでおります。 ある目的のタンパク質を動物細胞で発現させ、その発現をウェスタンブロッティングにより確認しました。 この目的のタンパク質を質量分析にかけたいので、SDS-PAGEをした後、ゲルを切り出したいと考えています。 CBB染色で染まるのが理想ですが、微量のタンパク質であるためにそれがとても難しい状態にあります。 そこで変法の銀染色により検出するのですが、かなり多くのタンパク質が検出されてしまって、目的のものの見当がつきません。 WBにより発現は確認できているので、ふと、WB後のメンブレンを銀染色すれば目的のタンパク質のおおよその見当がつくのではないかと考えたのですが、そのようなことは可能なのでしょうか？ もし知っている方がいましたら、ご教授よろしくお願いいたします。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---