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(無題) 削除/引用 No.1576-11 - 2008/07/17 (木) 17:25:19 - obakasan 皆様ご指摘ありがとうございます。目的のサイズらしきものは泳動で確認できております。名無しさまのご指摘を元にもう少し追加実験をしてみようと思います。ありがとうございました。 またよろしくお願いいたします。

むむむ 削除/引用 No.1576-10 - 2008/07/17 (木) 10:21:32 - 名無し まず、サンプル調製からblottingまでのチェック箇所です。 !) そもそも、意図する位置にそれらしいタンパク質が泳動されているのか？ 膜タンパク質など疎水性が高いドメインを持つタンパク質は、SDS環境中でboilすると、凝集して、濃縮ゲルに入らないことが有るようなので、SDS化や変性の条件(SDSから尿素などに)を変える(経験がないので、条件については詳しくありません、申し訳ないです) ") 目的のタンパク質がゲルから膜に転写されたことを確認するために、転写終了後、膜をポンソーSで染めるか、ゲルをCBBで染める。 ブロッキング後、一次抗体なし、二次抗体ありで検出してみるのはどうでしょう。 もし、同じサイズのバンドが検出されるのならば、二次抗体を変えると解決するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1576-9 - 2008/07/17 (木) 07:17:35 - mikan 4回もつかえたのですね。 そんなにやったことがなかったです。 参考になります。

(無題) 削除/引用 No.1576-8 - 2008/07/16 (水) 21:08:18 - obakasan 名無しさま、的確なご指摘ありがとうございます。 初心者で基本的なことばかりで申し訳ありません。 私の場合は、意図しないサイズのバンドが見られます。目的とするものよりも大きいサイズのもです。 以下に私のウエスタンの方法をお示しいたします。 1:sample・・THP-1　24h 37℃　5%CO2 でINF4000U/mlで刺激しincubateしたもの 2:SDS-PAGE・・Lower gel:12.5%,upper gel:4.5% 130V 75min running 3:blotting・・semidry・・110mA 60min nitrocellulose membrane 4:bloking・・4% non-fatmilk RT 1h incubate 5:1st Ab・・mouse polyclonal Ab （製品として売られているもの） 　　　　　　4℃ overnight 1:1000 6:2nd Ab・・HRP monoclonal goat anti-mouse IgG 1:5000 7:検出法・・ECL system（発光基質？） 抗体の濃度は会社が推奨している濃度で行いました。 一度使用したメンブレンから抗体をstrippingして抗体の濃度を振って実験していたのですがやはり意図しないサイズのバンドが見られます。メンブレンを４回目使用で（３回stripping)でメンブレン上に黒い斑点などが見られましたので、メンブレンの再利用は何回までかお聞きした次第です。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1576-7 - 2008/07/16 (水) 19:51:56 - 名無し 自分流の言葉を使ってしまいました。申し訳有りません。 non-specificな染まり方、というのは、抗体がブロッキング剤と反応してしまい、 メンブレン全体が発色している、という状態を指して言っています。 意図しないサイズのバンド、というのは、全くもってそのままの意味で、 例えば、本来60 kDa のバンドが染まるはずなのに、40 kDa や 100 kDaにも(にしか)バンドが見える、という状態です。 目的のサイズよりも低い位置にバンドがあるならば、分解産物であることが示唆されます。 高い位置にある場合は解釈が難しいのですが、polymerであることが考えられます。 westernでのトラブルでトピックを建てられるのならば、 サンプルの由来(細胞？血液？など)、調製法 SDS-PAGEの条件、Blottingの条件 ブロッキング剤の種類、ブロッキング時間、温度 一次抗体の状態(ポリクロ？モノクロ？自作？製品)、作用させた温度と時間 二次抗体の状態(たいていは製品ですが、標識の酵素の種類を開示する)、作用させた温度と時間 検出の方法(BCIP/NBT発色？H2O2/4-CN発色？、発光基質？) といった点を明示されると、解決への道が広くなると思われます。 長文失礼しました。

メンブレンの再利用 削除/引用 No.1576-6 - 2008/07/16 (水) 19:24:43 - obakasan みなさま、早速のご指摘誠にありがとうございます。 感謝いたしております。 まず、probe:探索する、探す　　strip：剥がしとる　でした。 私が思うに、reprobeは抗体が残ったままもう一度、strippingは抗体を全部除去してウエスタンをもう一度ということでしょうか？ ご指摘のように意図しないサイズのバンドで悩んでおります。 一次抗体は製品として購入したmouse-polyclonal抗体で製品書にはバンドが１本しか見られておりません。私がウエスタンブロッティングした場合はバンドが数本見られます。このバンドは、目的とされるサイズのバンドより大きいサイズのものが数本見られます。 そして、基本的でさらに質問して申し訳ないのですが、non-specificなバンドと目的としないサイズのバンドは同じ意味と思っておりましたが、名無しさまのご指摘では違う意味のようですがもう少し教えていただけますでしょうか？ お忙しい中申し訳ありませんがよろしくお願いいたします。

メンブレンの再利用 削除/引用 No.1576-5 - 2008/07/16 (水) 19:14:58 - obakasan

(無題) 削除/引用 No.1576-4 - 2008/07/16 (水) 19:06:30 - 名無し おそらく、non-specificな染まりか、 意図しないサイズのバンドで悩んでおられるのだろうと思います。 前者の場合、strippingやreprobingを繰り返すよりは、 何枚も膜に転写して、一次抗体、二次抗体の検討をする方が、無難かと考えます。 というのは、strippingで全ての抗体がはがれる、という保証はないですし、 残った抗体が、reprobingの後の発色に影響を及ぼす可能性もあるからです。 後者の場合、検出されたバンドが目的のタンパク質よりも大きいのか、小さいのかで、 対処が変わってきます。 もう少し、情報を開示されると、よりよいsuggestionが得られると思うのですが。 例えば、一次抗体は製品でしょうか？自作でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1576-3 - 2008/07/16 (水) 18:35:07 - - probeとstripの意味を調べてみましょう。 そうするとreprobing とstrippingは何をすることかわかるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1576-2 - 2008/07/16 (水) 18:32:02 - mikan 方法にもよるのだと思いますが ストリッピングの後はサンプルも 落ちるようで、1回が限度のように感じました。 私も初心者ですのでうまいやり方があれば 知りたいです。

メンブレンの再利用 削除/引用 No.1576-1 - 2008/07/16 (水) 18:24:27 - obakasan 現在、ウエスタンブロッティングを行っております。目的とするサイズのバンドが得られず試行錯誤しております。 そこで質問があります。メンブレンは何回再利用できるのでしょうか？ reporobing とstrippingをした場合再利用の回数は変わるのでしょうか？ 基本的なことで申し訳ないのですが、reporobing は表面を洗い流す（抗体は残ったまま？）、strippingは一次、二次抗体すべて除去するという解釈でよろしいのでしょうか？ 初歩的な質問で大変申し訳ありませんが、教えていただければ幸いです。

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