自分は、同じく、核と細胞質のRNAを分画したいと考えてAmbionのPARIS kitを使ってみたことがあります。
このキットは蛋白質とRNAを同時に分画できることがウリなのですが、自分の場合、蛋白質の分画もうまくいきませんでした。
具体的には、細胞質→核、核→細胞質のコンタミがが激しい上、同じ細胞質蛋白質でもコンタミの度合いが異なるのです。
これはdetergentを用いているため、溶出しやすいものとしにくいもので漏れ出し方が違うのかもしれません。
細胞は293細胞を用いていました。
lysis buffer中でのincubateの時間や細胞の懸濁の仕方など条件検討をしてみましたが、改善が見られなかったため、用手法の分画をすることにしてしまいました。
現在用手法により、なかなかの分画効率が得られたのですが、kitでうまくいくのであればそちらも用いたいと考えています。
このキット（および類似のもの）を使用した経験がある方で、うまくいったという方は、自分としても条件を教えてほしいです。
（Ambionのページでは、『ほぼ完全に分画できてます』みたいなウエスタンとRT-PCRの図が載っていてとても悔しいです。。）
スレ主さんへの解答になっていない、便乗質問ですがよろしくお願いいたします。 |
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