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同条件でのRT−PCR トピック削除
No.1569-TOPIC - 2008/07/15 (火) 21:41:37 - PCR
いつも勉強させていただいてます。

以前まできちんと増幅されていたPCRと同条件で行っているのに、今回急にPCRがかからなくなってしまいました。
その条件で増幅されることを確認済みのcDNAをテンプレートにして行っても増幅されなくなっている状態です。

アガロースゲル(2%)電気泳動で確認しますと、ウェル部分が強く光りそこからスメア状に広がっているように見られます。この現象は以前もいくつかのサンプルでみられていたのですが、大半はきちんと増幅されていました。
目的部分の長さは約100bpですが、その位置にバンドは全く見られません。
マーカーはきちんと流れていて、ノーテンプレートにはウェル部分の光りやスメアは見られません。

反応条件は以下の通りです。（これは以前に条件検討を行って最適化して決めたものです）
ポリメラーゼ：EX taq
アニーリング温度：50℃（48℃〜55℃まで検討しましたがうまくいきませんでした）
サイクル数：35サイクル（30サイクルではウェル部の光りは弱まりましたがスメアは無くなりませんでした）

同じ条件でもGAPDHは全てきれいに増幅されます。

スメア状になるのはDNA量が多いからと考え、テンプレート量もかなりいじってみましたが、うまくいきませんでした。
primerも替えてみましたがだめでした。

同じような経験をされた方やPCRに詳しい方などおられましたら、解決法などアドバイスして頂けないでしょうか？
よろしくおねがいします。
　
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(無題) 削除/引用
No.1569-7 - 2008/07/19 (土) 14:43:11 - AP
このケースがそうかどうかはおいて、同じ条件でやっているのに増えたり増えなかったりという場合、一般論としてこういうこともありますよ、ということでは、

サーマルサイクラーの不調やメンテナンスの不備という可能性もあります。
温度移行が緩慢になったり反応液が設定温度に達しなかったりしていると、増幅しなかったり、変な産物が増えてきたりすることがあります。

原因は、たとえば、
・ペルチェ素子の劣化で（最近では品質がよくなって起こりにくくなっていますが）、温度移行の速度が遅くなっていたり、温度制御が不安定になっている
・ヒートブロックのピットが汚れていたり、ごみがたまっていたりしてチューブとの密着度が悪くなっている
など

対処法セルフチェック機能がついているものでしたらチェックしてみる、あるいは温度移行の速度が仕様より遅くなっていないか時間を測ってみるといいでしょう。ブロックはときどき掃除するようにしたほうがいいですね。

(無題) 削除/引用
No.1569-6 - 2008/07/16 (水) 19:14:07 - in situ
-80℃での分解は考えにくいですが、凍結融解を繰り返す（および融解時の操作も含む）と分解することはあり得ます。

もし貴重なサンプルから抽出したものでなければ、もう一度取り直すことをお勧めします。
自分も、PCRがかからなくなった時に、もう一度取り直したら問題なくかかったことがあるので。

あと、貴重なサンプルから抽出する場合は、RNAを小分けにして保存した方がよいかと思います。

(無題) 削除/引用
No.1569-5 - 2008/07/16 (水) 16:27:51 - PCR
＞in situさん

分解の可能性については自分も考えていたのですが、他の方からも指摘されるとその可能性が高いように思えてきました・・・。
RNAからの逆転写は何度か行ってその度にGAPDHは確認していますが、元のRNA中の目的遺伝子が壊れている可能性はありますよね。

コピー数の少ない遺伝子であれば1回や2回の凍結融解でも分解されてしまったりするのでしょうか？
保存は-80℃にて行っていますが、この間に分解されてしまうことも考えられますか？

(無題) 削除/引用
No.1569-4 - 2008/07/16 (水) 15:24:07 - in situ
cDNAは新しく取りなおしたりしてみましたでしょうか？

GAPDHなどはたくさんあるので、多少分解されてもPCRで増幅されると思いますが、コピー数の少ない遺伝子に関しては保存状態によっては分解されてしまった可能性もあるかと。

(無題) 削除/引用
No.1569-3 - 2008/07/16 (水) 14:45:53 - PCR
＞atsさん

そういうことになります。
ですので、primerを他の人が使っているもの(同じprimerを別の日に注文したもの)にかえてみましたがダメでした。
新しいものを注文するとしたら、同じ配列のprimerで大丈夫でしょうか？
それとも新しいprimerを設計し直した方が良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1569-2 - 2008/07/16 (水) 09:43:02 - ats
GAPDHの反応系と異なるものは、primerでしょうか？
そうならば、primerを新規なものに変えてみてはいかがでしょうか。
最初に分注しておくと、トラブルを回避しやすくなります。

同条件でのRT−PCR 削除/引用
No.1569-1 - 2008/07/15 (火) 21:41:37 - PCR
いつも勉強させていただいてます。

以前まできちんと増幅されていたPCRと同条件で行っているのに、今回急にPCRがかからなくなってしまいました。
その条件で増幅されることを確認済みのcDNAをテンプレートにして行っても増幅されなくなっている状態です。

アガロースゲル(2%)電気泳動で確認しますと、ウェル部分が強く光りそこからスメア状に広がっているように見られます。この現象は以前もいくつかのサンプルでみられていたのですが、大半はきちんと増幅されていました。
目的部分の長さは約100bpですが、その位置にバンドは全く見られません。
マーカーはきちんと流れていて、ノーテンプレートにはウェル部分の光りやスメアは見られません。

反応条件は以下の通りです。（これは以前に条件検討を行って最適化して決めたものです）
ポリメラーゼ：EX taq
アニーリング温度：50℃（48℃〜55℃まで検討しましたがうまくいきませんでした）
サイクル数：35サイクル（30サイクルではウェル部の光りは弱まりましたがスメアは無くなりませんでした）

同じ条件でもGAPDHは全てきれいに増幅されます。

スメア状になるのはDNA量が多いからと考え、テンプレート量もかなりいじってみましたが、うまくいきませんでした。
primerも替えてみましたがだめでした。

同じような経験をされた方やPCRに詳しい方などおられましたら、解決法などアドバイスして頂けないでしょうか？
よろしくおねがいします。
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