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(無題) 削除/引用 No.1564-3 - 2008/07/16 (水) 15:35:30 - in situ おおさま アドバイスありがとうございます。 やはり、in vitro transcriptionの性質上仕方がないのですね。 今まで、in situ hybridizationのプローブをつくるのにin vitro transcriptionを用いていたため気にしていませんでした。 確かに、1.7kbは自分でも長いなと思うのですが、絶対定量を行うにあたって、RT効率が重要になることから考えて、できるだけ全長に近いRNAを合成したいと思った次第です。 早速おおさまのおっしゃるようにゲル抽出してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1564-2 - 2008/07/16 (水) 04:31:23 - おお in vitro transcriptionで程度の差さえあれど、目的の産物より短い物が得られます。邪魔な時は電気へいどうで切り出して精製するのが一般的です。 1.7kはちょっと長いですね。１キロ以下なら(1.7Kでもできると思いますがちょっと長いという感触はあります)6ー8M尿素を含むTBEーPAGEでながしてバンドをエチブロのようなものか、メチレンブルーで検出して、目的のところを切り出して、0.5Mサクサンアンモニウム、0.25%SDS、1mMEDTAでO/N抽出し、エタチンで80%ぐらいは回収されると思います。 PCRで増幅する場所と(場合によってはポリA)があれば、RTーPCRは成り立ちますので、その場所に絞ってもう少し短くした方が楽だと思います。500ベースぐらいでしょうかね。それでも切出しをした方がいいと思います。

絶対定量PCRのスタンダードに関して 削除/引用 No.1564-1 - 2008/07/15 (火) 12:42:00 - in situ いつもお世話になっております。 現在、realtime PCRによる絶対定量の系を立ち上げています。 具体的には ・目的のRNA（約1.7kb）をRTしてをTOPO vectorに入れる ・T7 RNA polymerase を用いてin vitro transcription ・ミニクイックスピンRNAカラムで精製 ・Nanodropで濃度測定 という手順でstandardを作製しました。 このstandardの希釈系列を作って、サンプルと一緒にRT⇒realtime PCRを行うことで検量線を書いたところ、非常に直線性が高い検量線が得られ、系は問題なくworkしているかな、と思っていました。 しかし、念のため、standardのRNAを変性アクリルアミドゲルで泳動して銀染してみたところ、ラダー状のバンドが見えました。 確かに、目的の大きさのものがメインに見えてはいるのですが、その下にラダーがたくさん出るわ出るわ。 これでは、絶対定量ができてるとは言えません。 ということで、今回の質問は以下の二つです。 ・このようにラダー状になるのはT7とかSP6 RNAポリメラーゼの性質上仕方がないことなのでしょうか？（長いと転写がうまくいかないというのは聞いたことがありますが、、） ・このような状態から目的の大きさのRNAのみを精製する方法ご存じの方いらっしゃるでしょうか？（ゲル切り出し？）

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