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(無題) 削除/引用 No.1561-12 - 2008/07/17 (木) 14:02:41 - ビギナー seaさん度々ありがとうございます。 たくさんヒットしました(^^;) 参考にさせてもらいます！ これで解決とさせていただきます！ 皆さんありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.1561-11 - 2008/07/17 (木) 13:33:02 - sea > > お使いの細胞の種はなんでしょう？ > ラットの細胞です > SANTA CRUZの抗体でラットにも特異性はあるものです 実は気になっていたのはまさにこれで、こういうところで 特定のメーカーについてどうこう言うのはまずいのかもしれませんが、 Santa Cruzではよく経験されることのような気がします。 なので同じクローンがほかの会社から手に入るときは 複数のデータシートを参照するようにしています。 私なら、文献などで同じクローンでラットの細胞なり組織で ウェスタンをやっている論文があるか調べてみると思います。 googleで"western blot hsp70 w27 rat" っていう感じで。

(無題) 削除/引用 No.1561-10 - 2008/07/17 (木) 12:01:15 - ビギナー > お使いの細胞の種はなんでしょう？ ラットの細胞です > HSP70のW27というモノクロのクローンはあちこちの会社から出ていますが、私の見た限りでは、reactivityはヒトだけもしくはヒトとCow、とか そんな感じでラットやマウスについて記載されている例は少ないような 印象です。 SANTA CRUZの抗体でラットにも特異性はあるものです さらにHela細胞で実験を行ったところ、はっきりと検出できました。これもヒトですね。。。 ラット肝癌細胞(H4-2-E)ではなぜ検出できないのでしょうか(^^;) さらに追試を行ってみます！ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.1561-9 - 2008/07/16 (水) 09:22:03 - sea お使いの細胞の種はなんでしょう？ HSP70のW27というモノクロのクローンはあちこちの会社から出ていますが、 私の見た限りでは、reactivityはヒトだけもしくはヒトとCow、とか そんな感じでラットやマウスについて記載されている例は少ないような 印象です。 ヒトの細胞でない場合、反応性はあまり期待できないかもしれません。 HEKはヒト由来なのでポジコンとして使用するのに必要十分と思いますが、 お使いの細胞と同じ動物種でのポジコンもあったらいいと思います。 通常はHSP70はcytosolicなタンパクなはずなのでとりたてて特別な 方法でなくてもHSP70を含むfractionは溶出できるような気がしますが、 ほかにその抗体を使ってその細胞、もしくはその細胞と同じ動物種の 細胞を使ってウェスタンをしている論文があればそれに準じた方法を とるのが近道じゃないかな、と思います。

(無題) 削除/引用 No.1561-8 - 2008/07/15 (火) 12:25:20 - ビギナー 度々ありがとうございます。 超音波による破砕も行いましたがだめでした。 どうも私の今培養している肝がん細胞に原因があるのではないかと考えていますが、バンドがうっすらとも出ないので不思議です。 みなさんの意見を参考に試行錯誤して実験し、うまくいかないようならもう一度相談させていただきます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1561-7 - 2008/07/15 (火) 03:12:07 - 名無し 抗体ok特異性okならばSDSサンプルバッハで細胞直接とかして超音波してみればどうでしょうか　というのはリパバッハだと全部の蛋白質とってこれないとおもうから　なんかあれ弱い感じするしいつも。でもhsp70ならてかなり適当に細胞こわしてもふつうに簡単に溶けてでてくるようにも思うけど。もしか熱処理したあと時間的にはやすぎてまだ蛋白質レベルでばっと増えてくる前にサンプリングしてるとかそれかはんたいにすごいおそすぎてベースラインまでもどってしまってからサンプリングしてるとかかもだからタイムコスとってみたらそういうのがわかるかもとかもちょっとおもいました。でもふつうのときでもhsp70あるていどとあるけど。

(無題) 削除/引用 No.1561-6 - 2008/07/14 (月) 21:48:18 - ビギナー ありがとうございます。 rat,mause,humanに特異性があるので大丈夫かと思います。 論文などを見るとRIPA bufferはあまり使われてません。 もしかすると、これが原因でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1561-5 - 2008/07/14 (月) 18:47:12 - 名無し 抗体モノクロ？だとしたらヒトのHsp70とは反応するけど他の動物種由来の細胞だと場合によってはhsp70はいっぱいあっても反応しないかもたぶん。交差する動物種は何々ですと抗体の紙に書いてあると思うから見た方がいい。

(無題) 削除/引用 No.1561-4 - 2008/07/14 (月) 17:43:42 - ビギナー 返信ありがとうございます。 他の方がHEK293でHSP70を見られたサンプルを借りてポジコン(？)としましたが、やはりポジコンはしっかりとバンドが検出できました。抗体自体は正常であると考えています。 しかし、確かに同じ細胞で熱処理などのポジコンを取るべきですね。 今回は栄養飢餓培地を用いる条件があったので、それをポジコン代わりに用いていました。 HSP70の抗体はHSP70(W27)と書いてあります。 情報が少なくてすみませんでした！本当に無知ですので何かありましたらご指摘していただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.1561-3 - 2008/07/14 (月) 17:06:24 - つん もっと詳しい情報がないと何とも言えませんが… HSP70とありますが、もしinducible HSP70（HSP72）のことであれば、42−43℃で1hの温熱処理後、37℃で5−6hインキュベーションしたものがポジコンになります。

(無題) 削除/引用 No.1561-2 - 2008/07/14 (月) 16:30:46 - T 抗体自体に問題はないのですか？ ポジティブコントロールはうまくいっているのでしょうか？

HSP70のウエスタン 削除/引用 No.1561-1 - 2008/07/14 (月) 16:07:27 - ビギナー 今、肝癌細胞でHSP70のタンパク質を調べようと思ったのですが、WBで全くバンドが見えません。 RIPAで回収して3000rpmで5min程遠心した後に上清をサンプルとして用いました。 全く方法が間違ってるかもしれません。 HSP70を検出する際の、細胞からの回収方法を教えてください。

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