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(無題) 削除/引用 No.1557-6 - 2008/07/15 (火) 23:42:42 - おお DIGなどのラベルがいいかもしれませんね。 ただし、こういった実験は基質にそういうものを入れるのを嫌う傾向にあります。構造、酵素の親和せいに影響がある可能性があるからです。ちょっとラベルの場所など工夫が必要かもしれません。 または、ラベルなしの基質でメンブレンにトランスファーしハイぶりで検出するほうほう何かも取れるかもしれません。あとはRNA/DNAのばあいだとRNaseH処理とか、プロテクションアッセイのような手法に持ち込んでも何とかなるかもしれませんね。 ただ私はチェックしていませんがRIでやっている実験はラベルしたものだけを見ていますので、見えないDNA/RNAがどれだけあるかで、違う検出方法を取った時見え方が可也違う可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.1557-5 - 2008/07/15 (火) 19:54:51 - とも 僕もそれを考えていました。DIGだとメンブレンにトランスファーしなければならないので、蛍光の方がいいかなって思っています。できるかわかりませんが、やれることはやろうかなって思っています。

(無題) 削除/引用 No.1557-4 - 2008/07/15 (火) 17:42:16 - 名無し おおさんのレスを見ると、 短鎖の方の5'なり3'なりの末端に蛍光をつけておいて、蛍光を出すバンドの移動度を見る とか、 短鎖をDIGラベルしておいて、anti-DIG-APでバンドを検出する というのもいけそうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.1557-3 - 2008/07/15 (火) 15:01:50 - とも おおさん お返事ありがとうございました。 わかりやすくて参考になりました。 うちの研究室ではRI使えないので何か工夫しなければいけませんね。 一度なんらかの実験をやってみます。

(無題) 削除/引用 No.1557-2 - 2008/07/14 (月) 16:32:28 - おお 見たことはないのですが、何度かアッセイをしている文献を読んだことがあります。非常に単純で2本鎖になるDNAやRNAまたはDNA/RNAを用意してはがれるかどうかをみるというものです。そんなに長くない一本鎖DNAまたはRNAを用意して(たぶん100merぐらいまたはM13を利用してssDNAをつくる)それと相補的な配列をもつ20merぐらいのDNAまたはRNAを用意します。後者のオリゴマーをラジオラベルして、前者とアニーリングさせます。これを電気へいどうすると、100merとくっついている限りは移動度が遅いのですが、ヘリケースによってはがれると移動度が早くなり電気へいどうで見分けがつくというものです。ヘリケースによっては3'や5'に突出していたり、あにいリングしていない部分があったりした方が活性を発揮するものもあるので、その辺のアプローチをどうするかというのはあると思います。また、2本さでなく特殊な構造を解除するヘリケースもあるようなので、そう言うのはその構造を取るように仕組んでやらないといけないと思います。最近はタンパクと核酸の相互作用を外すヘリケースもあるのではないかと考えられています。 あとATP依存せいも見なければいけないでしょうね。

ヘリカーゼ活性の見方 削除/引用 No.1557-1 - 2008/07/14 (月) 08:09:22 - とも あるタンパク質にヘリカーゼ活性があるかどうかみたいのですが、見たことある人いますか？

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