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(無題) 削除/引用 No.1554-9 - 2008/07/13 (日) 17:13:24 - AP >環状化を防ぐ方法ですがAPさんがおっしゃているように >DNA断片の濃度を上げて、反応時間を短くすればよいのでしょうか？ 環状化より重合が優先的になるようにするにはDNAの濃度を高くするのがいいです。逆に、inverse PCRの鋳型を調製するときのように、環状化が優先的に起こるようにするには、DNAの濃度をうんと低くするのがいいです。 重合と環状化のどちらが優先的に起こるかという理論的な濃度計算は、たしかTAKARAのカタログのligaseの項に出ていたと記憶します。 短時間にしたほうがいいというのは、時間を延ばすと際限なく重合が起こってしまうからです。 でも、おおさんのアイデアのように、ligation後に、XhoI, SalIで切ってやるという方法なら、重合しすぎや環状化の問題も一気に解決しそうです。 XhoI-SalIの組み合わせで3回連続でligationが起こり、その両末端がXhoI-XhoI, SalI-SalIでligationされていればいいので、1/2^5=1/32の確率ですかね。十分、見込みありますね。

(無題) 削除/引用 No.1554-8 - 2008/07/13 (日) 16:33:00 - おお もっと単純に行けるかもと思いました、Xho1とSal1がつながった部分はXho1でもSal1でも切れないと思います。ですからライゲーションしたものをXho1でとSal1できれば、リニアなものは増えるはずです。その状態で電気えいどうし、欲しいサイズあたりのところをきりだせばいいかとも思います(スメアーでバンドがみにくても良いのではとおもいます)。この場合はXho1あるいはSal1同市のライゲーションプロダクトは理論上えられません。 すでに指摘がありますように濃度は濃くした方がセルフで環状になったものを防ぐことができますのでその方がいいと思います。 次に少しめんどくさい方法としては、PCRプロダクトを半分にわけて、一方をSal1、残りの半分をXho1で処理し、両者を混ぜてライゲーションすればより確実に2カイリピートが作れますね。 またXho1で処理したものをそれだけでライゲーションするとインバーテッドだけが得られると思います。で両側にSal1が切られず残った状態です。これをSal1で処理してからXho1だけで処理したものとまぜライゲーションし、Sal1で処理するとセルフで環状化されたものは直さに戻りますがXho1同士のライゲーションとXho1-Sal1間のライゲーションは切れませんので、直さでなんかいかリピートしたものがとり安くなると思います。向きが問題な場合は問題になるかもしれませんが。 しかしPCR末端にSal1は難しくないでしょうか、、、うまくいっていればそれでいいのですが。

(無題) 削除/引用 No.1554-7 - 2008/07/13 (日) 16:07:57 - ~ 自分でもXho-Salをやったことがあるのに忘れてました。 一度XHo,Salで切ったpBSベクターなどに入れて、 ----Xho--(insert1)---Sal-- をつくり、Salで切って、 ---Xho--(insert1)-Sal- -Sal----- にして、 Xho-Salで切ったインサートを入れて、 ---Xho--(insert1)-Sal-Xho--(insert2)--Sal-Sal----- ---Xho--(insert1)-Sal-Sal--(insert2)--Xho-Sal----- の2種類のうち上のほうを制限酵素地図などで調べる。 というので、1つずつ伸ばしていくこともできるはずです。 (中のXho,Salは全部つぶれるので、最後にXho,Salで切り出せます) 一度に3,4個とるのに手間どるようならば、保険でこちらもやっておいたほうが安心です。 pBSでXho,Salは隣接していますが、昔使ったので切れるはずです。 また、タンデムリピートだとデリーションしやすいので、 最低でも培養温度を30度以下にして、 できればタンデムリピートを安定に保持できるStbl4などのコンピを使ったほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1554-6 - 2008/07/13 (日) 13:34:49 - 匿名 みなさん書き込みありがとうございます。 やはり環状になっているためにスメアに見えたのですね。 環状化を防ぐ方法ですがAPさんがおっしゃているように DNA断片の濃度を上げて、反応時間を短くすればよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1554-5 - 2008/07/13 (日) 10:54:11 - AP >例えばSalI digest→脱リン酸→XhoI digestすると、すこしはましかな？ 必ず一定方向にタンデムになるようにするならこういう方法もあります。 例えば、 プライマーの一方を5'-AAAAGGGGNNNNNNNN もう一方を5'-TTTTGGGGNNNNNNNN とし、 PCR産物を精製後、（ポリメラーゼとdNTPを除く）、dCTPをたっぷり加えてT4 polを効かせると、 3'端のAまたはTが削れて 5'-AAAAGGGGNNNNNNNN ------>CCCCNNNNNNNN 5'-TTTTGGGGNNNNNNNN ------>CCCCNNNNNNNN こうすると一方向にしかligationしません。 プライマーがリン酸化されていない場合は、リン酸化が必要ですね。

(無題) 削除/引用 No.1554-4 - 2008/07/13 (日) 10:26:39 - AP ligation産物を泳動すると、きれいにバンディングしないことが多いですね。 たいていは高分子にピークがきて、スメアするような感じで。 ligation反応は結構速いので短時間で多数重合してしまうし、linearだけでなくcircularもできるからでしょうか。 環状化を防ぐためDNA断片の濃度を上げて、反応時間をうんと短くすると（数分いない）、4つくらいの重合体も取れるかもしれません。 SalI, XhoIはcompatible endですからどっち向きにつながるかはランダムになると思いますが、それでいいのでしょうか。 例えばSalI digest→脱リン酸→XhoI digestすると、すこしはましかな？

(無題) 削除/引用 No.1554-3 - 2008/07/13 (日) 10:26:13 - TK-1 >[Re:2] ~さんは書きました : > その制限酵素サイトのつけ方だと、タンデムではなくて、 > 交互に逆向きの配列が来ませんか？ XhoIとSalIならcomplementary overhangなので、orientationはランダムになります。 ligationの条件をcirculationよりもlinearでおこる条件で、やれば出来ると思います。スメアになったのはcircular ligation productではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1554-2 - 2008/07/13 (日) 10:13:18 - ~ その制限酵素サイトのつけ方だと、タンデムではなくて、 交互に逆向きの配列が来ませんか？

タンデムコピーの作製法 削除/引用 No.1554-1 - 2008/07/12 (土) 20:49:45 - 匿名 ある遺伝子（A)を３つ、４つつなげたコンストラクトを作成しようと思い、まず5’末にXhoI制限酵素サイト、3’末にSalI制限酵素サイトを付加してPCRをかけAを増幅し、次にXhoI、SalIで処理し、ライゲーションしたのですがバンドがスメアになってしまいました。予想だとAが２つ、３つあるいはそれ以上つながった長さの塩基数の位置にバンドが見えると思っていたのですが、どなたか詳しい人がいたら教えていただけると助かります。

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