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(無題) 削除/引用 No.1551-25 - 2008/08/01 (金) 14:38:28 - EcoRI そうですね…固定の場合はトライ＆エラーが必要かな、と思います。 BN-PAGEで自分の見たいタンパク質を考えた場合、 やっぱりグラジエントがよさそうに思えます。 私の場合、BN-PAGEにこだわらず、たとえば SDS-PAGE(+2ME, -2ME)とゲルろ過のデータを組み合わせて、 コンプレックスの組成や結合様式を明示してもよさそうに思えます。 こんなところがタンパク質実験の面白みであり、難しさなんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1551-24 - 2008/08/01 (金) 14:15:27 - おお >[Re:21] EcoRIさんは書きました : > SDS-PAGEのような目安はなさそうに思います。 > ご存知の方がいらっしゃったら是非教えて頂きたいのですが。 目安は発表されたデータ(クラジエントをふくむ)などからの推測はできると思います。ただし分子量にどれだけ忠実かというのが問題です。 例えば http://www.invitrogen.co.jp/electro/BN-PAGE.pdf 6ページ位のところに3ー12と4ー16のゲルの電気えいどう例がのっていますが、3ー12の真ん中あたりに480kDaのマーカーが来ていますので、グラジエントがリニアなら7.5%のところで480kDaはほとんど動かなくなり止まってしまうようにみえます。同様に4ー16を参考にすると10%付近で242kDaのマーカーが動きが取れなくなるだろうと考えられます。 400kDaが見るべきものの最大のコンプレックスであれば最小のものがどれくらいかによりますが、6%均一ゲルを使ってみようかなという気なりますし、250kDa付近なら10%はちょっと多いだろうと思えます。 実際に50kDaのものがダイマーになり100kDaになるようなものにこんなワイドなレンジは必要ないですし50ー100kDaあたりの分解能はインビトロジェンのグラジエントゲルではではあまりよくありません。50kDaのものが20kDaとヘテロダイマーとかいう状態なんで説得力あるデーターなんか出そうにありませんね。 サンプルが多く取れないというのはちょっと痛いですが、まずは均一ゲルでマーカーでどれくらいのレンジがみれるか 確認して、その前後の%でいい条件がないか見てみるのもてかと思います。検出したいサイズか複数ある場合(複数あると思いますが)そのサイズのひらき方でも変わってくると思います。1000と20kDaをみたいなら均一ゲルではちょっと厳しいかなというかんじです。

(無題) 削除/引用 No.1551-23 - 2008/08/01 (金) 12:42:15 - EcoRI ajiさん、ありがとうございます。 私が固定に少しこだわっているのは、 ラボにプレキャストを買うほどの余裕が無いこと、 したがって、グラジエントゲルは自作になり、再現性を高めべき だが、サンプルはそれほど多くは作れない という状態なんです。 一枚ぐらいなら買ってもらえるかな… 何はともあれ、ありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.1551-22 - 2008/08/01 (金) 12:00:17 - aji > SDS-PAGEのような目安はなさそうに思います。 ある程度は分子量とゲル濃度は対応するはずです。ただこの分子量ならこの濃度を使ってください、という対応表を持っている訳ではないので、お勧めとしてはまず一回グラジエントゲルで流すことです。BN-PAGEに限らずNative-PAGEはタンパクの持つ電荷が小さいので、グラジエントゲル中ではどんなに長時間流してもある位置でほぼ完全に止まってしまいます。リニアーグラジエントなら長さを測ればバンドの位置のゲル濃度が大体分かります。その濃度より少し低くすれば適度な移動度が得られる、という感触です。とは言ってもその辺でゲル濃度を3段階ぐらい振らないと目的に合ったものは得られないと思います。 もし、分子量が完全に分かっていて、どうしてもグラジエントゲルを使いたくないのでしたらインビトロジェンの分子量マーカーの写真を定規で測ればある程度予想出来ます。ただ、所詮Native-PAGEなので分子量の信頼度もその程度、と思ってください。

(無題) 削除/引用 No.1551-21 - 2008/08/01 (金) 09:37:04 - EcoRI ajiさん、おおさん ありがとうございます。 >固定濃度ではオリゴマーはゲル上端で止まり、モノマーは下端という悲劇も起こったりします。BN-PAGEのグラジエントの利点は分離能よりは広い解析域を保障することだと思います。 なるほど… これも見たいタンパク質によりけり、ということでしょうか やってみなければわからない、と。 >ただどのサイズならどれくらいの% これも難しいですね コンプレックスによって、どのようなサイズの構成成分がどのように結合しているか様々ですし SDS-PAGEのような目安はなさそうに思います。 ご存知の方がいらっしゃったら是非教えて頂きたいのですが。

(無題) 削除/引用 No.1551-20 - 2008/08/01 (金) 00:01:51 - おお >[Re:18] EcoRIさんは書きました : > BN-PAGE のゲルはグラジエント限定なのでしょうか？ わたしはグラジエントを使わない予定です。BN-PAGEは非常に大きなコンプレックスをみるアプリケーションとして使えるので、そのときはグラジエントのほうがいいと思います。目的のサイズによっては均一なゲルでも良いと思います。ただどのサイズならどれくらいの%という判断は今の私の知識では結論が出ないです。

(無題) 削除/引用 No.1551-19 - 2008/07/31 (木) 20:46:34 - aji > BN-PAGE のゲルはグラジエント限定なのでしょうか？ > 例えば、8%の固定ゲルで流す、ということはできないのでしょうか？ ご指摘のようにグラジエントである必要はありません。複合体解析が目的の場合、例えば300kのタンパク質複合体のモノマー、ダイマー、、オリゴマーどれがメジャーか解らなかったり、同時にすべてをゲルで見たい場合、固定濃度ではオリゴマーはゲル上端で止まり、モノマーは下端という悲劇も起こったりします。BN-PAGEのグラジエントの利点は分離能よりは広い解析域を保障することだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1551-18 - 2008/07/31 (木) 17:50:46 - EcoRI 興味を持ってトピックを読まさせて頂きました。 調べてみると、以下のページに、western blot までの手順が記載されていました。 http://www.pssj.jp/archives/Protocol/Measurement/blue_01/blue_01_01.html BN-PAGE のゲルはグラジエント限定なのでしょうか？ 例えば、8%の固定ゲルで流す、ということはできないのでしょうか？ グラジエントの方が分離能がいい、というのはわかります。 例えば、見たいコンプレックス(と思われるもの)は既に精製されてあって、 それらの構成成分や結合様式を見たいだけ、 といった場合、それほど分離能が高くなくてもいいような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1551-17 - 2008/07/31 (木) 12:18:11 - おお 皆さんありがとうございました。大分様子が分かってきましたので、手元にあるもの、てっとりばやく入手可能なものをかき集めて、工夫しながら系を立ち上げれそうです。もうすぐリコンビナントを担当している人が精製にかかると思いますので、その出来しだいで応用できるかもしれません。

私もちょっとお聞きしたいのですが・・・ 削除/引用 No.1551-16 - 2008/07/29 (火) 22:29:43 - たろ 私もちょっとお聞きしたいのですが、InvitrogenのBN-PAGEのプロトコルではwestern blottingも可能とのことですが、どなたか（SDS-PAGEのwesternでは染色できなくなってしまうような）conformation-dependentな抗体を使ってBN-PAGEからwesternまで行っている方はいませんか？「blot後に８％の酢酸でCBBを良く洗って・・・」等と書いてありますが、conformationを保ったままうまく染めるられるものなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1551-15 - 2008/07/16 (水) 13:25:52 - R 経験論ですが。 Schaggerの"Membrane Protein Purification and Crystallization"という本を参考にして何度か遊びで試しました 落とせなかったため読んでいないのですが、恐らくNature protocolの論文と同じだと思います。 Blue native PAGE Nature Protocols 1, - 418 - 428 (2006) 試薬やゲルは全て自作、やったのは一次元目にBN-PAGE、レーンを切り出して二次元目にSDS-PAGEを行う二次元展開です。 細胞を丸ごと界面活性剤を含むLysis Bufferで可溶化し、Blue-Native-PAGEにかけた結果、様々な膜タンパク質複合体の他に、26Sプロテアソームや水溶性キナーゼの複合体などもきれいに分離されました。 このことから、水溶性でも界面活性剤を加えてかまわない場合もあるようです。 ただ、結合相手が多いタンパク質や、結合が一過性のタンパク質についてはブロードになってしまう印象があります。 界面活性剤は今のところTriton X-100、DDM、ジギトニンを試しましたが、どれを使用するかによって若干結果が変わってきます。 Triton X-100よりはDDM、DDMよりはジギトニンの方がマイルドで複合体の保存性はいいです。 マーカーはNative-PAGE用のマーカー（Invitrogenなど）などが流用可能だと思います（使ったことはないです）。

(無題) 削除/引用 No.1551-14 - 2008/07/15 (火) 09:51:17 - あべちゃん > CN-PAGEはWEBで引っかかってきたので、あとで文献を見なくちゃとチェックをいれておいたもののひとつです。チェックしただけでまだ読んでいません。クリーンネイティブの略なんですね、、、てなんか普通のネイティブの電気えいどうにかっこよく名前つけただけのようなきもしますが、、 私の調べていたまく蛋白質の複合体に関して言えば、Davis系Native-PAGEより分離能がよくまた、ブルーネイティブよりもin-gelでの酵素活性も維持されており、便利でしたが、用途によると思います。 > > 電荷が中性のDDMを片方の電極に入れておくと言うのもちょっと不思議な感じがしますね。あとデオキシコール酸は負電荷をもつのでサンプルと結合すると移動度が変わってくるような気もしました。マーカーも一緒の条件なのでいいのでしょうね。 逆に、デオキシコール酸を添加しないと、泳動／分離されません。DOCはSDSやブルーネイティブのG250と同じ電化を付与する役割を果たしています。

(無題) 削除/引用 No.1551-13 - 2008/07/15 (火) 09:13:49 - あべちゃん > BPBと同じですが、シェガー先生の論文を読むと、２次元目にトリシンゲルを使うためにBPBよりもCBB-G250が良い、と言う記載があり、インビトロジェンのPonceau Sはサンプルをロードするのに僅かにでも見やすくする目的だと思います。 あと、Ponceau Sは、泳動の目安になります。 マーカーは、invitrogenのNativeMark (Unstained Protein Standard）を使っています。

(無題) 削除/引用 No.1551-12 - 2008/07/14 (月) 20:28:27 - aji > 実験のアプローチからみて、膜タンパク用にプロトコールがスタンダダイズされていますね。 インビトロジェンのWebサイトからマニュアルがダウンロード出来るので参考になります。水溶性タンパクにはやはり界面活性剤は使わないようです。 > 0.1% Ponceau Sの役割は何でしょうか、SDSPAGEのBPBとおんなじような感じですか?わざわざこれに変えたとすると訳ありかな、、、 BPBと同じですが、シェガー先生の論文を読むと、２次元目にトリシンゲルを使うためにBPBよりもCBB-G250が良い、と言う記載があり、インビトロジェンのPonceau Sはサンプルをロードするのに僅かにでも見やすくする目的だと思います。カソードバッファーは真っ青で、始めてのときはビックリします。 ちなみに、すべて自作で出来ますが、インビトロジェンのキットは優れものです（回し者ではありません）。CBBだけはインビトロジェンのものが一番です。

(無題) 削除/引用 No.1551-11 - 2008/07/14 (月) 17:14:00 - おお >[Re:9] pageさんは書きました : >リコンビナントタンパク質を用いた解析の成績はかなり良いと感じます。CBB量は重要だと思います。特にNP-40等の使用の有無に応じてCBB量を調節しなければならないと思います。 ありがとうございます。私の考えている系と同じような実験を組んでらっしゃるかなと思いました。インビトロジェンのわたしが参考にしたものでは、CBBとタンパクの結合にあまり影響のないDDMなどが選択しになっていましたが、NPー40でも工夫をすればいけるのですね。 NP-40は非常に大きいミセルを作りますので、そのミセルに乗ってタンパクが動いたりしないかちょっと心配なのですが、それをどのように判断できるのかなと思いました。 >記載に従い限界までCBBを上げてもコンプレックスの乖離は認められませんでしたが、少なすぎるとゲル濾過での推定分子量と100K以上の差が認められたりと、 条件によってはサイズが適切なところに来ないとの指摘ですが、同一条件でマーカーを流してもダメなんでしょうか、、、というかマーカーをどうするのかというのが分からないのですが、、、、 なんか文献をまだ読んでないのがもろわかりの質問ばかりしてます、、、

(無題) 削除/引用 No.1551-10 - 2008/07/14 (月) 17:00:25 - おお >[Re:6] あべちゃんさんは書きました : > ブルーネイティブをお調べならば、ハーマン・シェーカー先生をご存じだと思います。彼らは最近、ブルーネイティブ(BN-PAGE)にかわってクリーンネイティブ(CN)PAGEという非変性PAGEについていくつか報告しています。 > それらの論文をまとめたようなのが下記の論文になります。 > > Mol. Cell. Proteomics (2007) Vol.6 No.7 pp.1215-1225 > > この論文について、端的に言うと、BN-PAGEはローディングサンプルに対してCBBをSDSの用に使うのに対し、CN-PAGEはカソードバッファーにDDMなどを添加して電気泳動します。 CN-PAGEはWEBで引っかかってきたので、あとで文献を見なくちゃとチェックをいれておいたもののひとつです。チェックしただけでまだ読んでいません。クリーンネイティブの略なんですね、、、てなんか普通のネイティブの電気えいどうにかっこよく名前つけただけのようなきもしますが、、 実験のアプローチからみて、膜タンパク用にプロトコールがスタンダダイズされていますね。DDMなどのデタージェントの選択や、濃度がたしかにカギになりますね。私はいまのところ水溶性のたんぱく質を使う予定なのでまったくデタージェントは必要ないかもしれません。 電荷が中性のDDMを片方の電極に入れておくと言うのもちょっと不思議な感じがしますね。あとデオキシコール酸は負電荷をもつのでサンプルと結合すると移動度が変わってくるような気もしました。マーカーも一緒の条件なのでいいのでしょうね。 あそうだマーカーとかはどうするのでしょうか? あと、数十KDaの2種類のたんぱく質の結合なのでゲルとしては10%ぐらいの均一なゲルのほうが分解能がいいかもしれないなと思いました(単純に1対1であれば100kDa強ですし)。 バッファーはやっぱりいろいろありますね、インビトロジェンでイミダゾールを使うものが示されていましたが、MESを使うというのもあるようです。 > サンプルに対してDDMあるいはdigitoninを加え、on iceでしばらく可溶化させます。その後、100kG 10 min程度遠心して、可溶化しきれなかった脂質などをのぞき、その上清に対して10x loading buffer (50% glycerol and 0.1% Ponceau S)を加え、ゲルにアプライ。 0.1% Ponceau Sの役割は何でしょうか、SDSPAGEのBPBとおんなじような感じですか?わざわざこれに変えたとすると訳ありかな、、、

(無題) 削除/引用 No.1551-9 - 2008/07/14 (月) 01:38:44 - page 私は、プレキャストゲルを含む全ての試薬をインビトロジェンで購入してBN-PAGEを行っております。非常に良くできたシステムという印象です。リコンビナントタンパク質を用いた解析の成績はかなり良いと感じます。CBB量は重要だと思います。特にNP-40等の使用の有無に応じてCBB量を調節しなければならないと思います。この辺はインビトロジェンのBN-PAGEの説明書(PDF)にも記載があったかと思います。私の一例でしかないのですが、記載に従い限界までCBBを上げてもコンプレックスの乖離は認められませんでしたが、少なすぎるとゲル濾過での推定分子量と100K以上の差が認められたりと、CBB量、NP-40量と、いくつかの予備実験を必要としました。DTTは泳動中に生じるタンパク質の酸化を防止するために加えますが、リコンビナントでもしその心配が無いようなものを扱ってらっしゃるのでしたら、特に心配はないかもしれません。

すみません2 削除/引用 No.1551-8 - 2008/07/13 (日) 23:35:06 - あべちゃん 機種依存文字を使ってしまったようです Schagger先生と書きました。(aは、aの上に点2つです） あと、ついでにサンプルにカリウムやニ価金属を含むと可溶化の不十分な脂質との影響で、泳動がかなり乱れます。

すみません 削除/引用 No.1551-7 - 2008/07/13 (日) 23:32:48 - あべちゃん

Schägger先生 削除/引用 No.1551-6 - 2008/07/13 (日) 23:30:15 - あべちゃん ブルーネイティブをお調べならば、ハーマン・シェーカー先生をご存じだと思います。彼らは最近、ブルーネイティブ(BN-PAGE)にかわってクリーンネイティブ(CN)PAGEという非変性PAGEについていくつか報告しています。 それらの論文をまとめたようなのが下記の論文になります。 Mol. Cell. Proteomics (2007) Vol.6 No.7 pp.1215-1225 この論文について、端的に言うと、BN-PAGEはローディングサンプルに対してCBBをSDSの用に使うのに対し、CN-PAGEはカソードバッファーにDDMなどを添加して電気泳動します。 私は、DDMやdigitoninの添加量ををサンプルタンパク質量に対してtitrationして、自分が観たい蛋白質を含む複合体の挙動を観察して条件検討しています。 具体的には、ゲルはinvitrogenのBN-PAGEに用いられているNative gradient gelを使用しています。 バッファーは、上記の論文に記されているhigh resolution Clean Native PAGE version 3のカソードおよびアノードバッファーを20xで作り、その都度、希釈して泳動しています。 サンプルに対してDDMあるいはdigitoninを加え、on iceでしばらく可溶化させます。その後、100kG 10 min程度遠心して、可溶化しきれなかった脂質などをのぞき、その上清に対して10x loading buffer (50% glycerol and 0.1% Ponceau S)を加え、ゲルにアプライ。 100V 10min泳動し、サンプルがゲル内に入れば、250Vで100minほど泳動します。この条件下で、上記のinvitrogenのプレキャストゲルならば20-2000kDaまで観ることができます。 私の場合、800kDaと2000kDaのコンプレックスを観る必要があり、 可溶化の際のDDMやdigitoninとサンプル蛋白質量の比が最も重要でした。 このゲルを少し水で洗った後に、TowbinのトランスバッファーにてPVDFに転写すれば、通常通りのimmunoblotもできますし、gel stripsをSDS-PAGEにて2次元展開すればcomplexの構成因子についても調べることができます。 もしも、20-2000kDaの範囲内で調べたいのでしたら、invitrogenの回し者では無いですが、gradient gelは自作よりプレキャストの方が再現性／時間などの点で良いと思います。 最後に アノード泳動バッファー imidazole/HCl [pH7.0] 25 mM カソード泳動バッファー Tricine 50 mM imidazole 7.5 mM DDM 0.01% (お好みで量を変える） sodium deoxy cholate 0.05% (お好みで量を変える) pH調整不要だが、おおよそpH7.1前後になることを確認する です。

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