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(無題) 削除/引用 No.1549-4 - 2008/07/12 (土) 22:50:22 - yuki おおさん、 御教示ありがとうございます。一度、コロニーが物理的に十分な大きさになるまで待ってみます。ただ２−３ヶ月くらい培養しないとクローニングにもっていけないような気がします。 ~さん、 不明瞭な書き方で申し訳ありませんでした。私の場合ソフトアガー"中"からのクローニングです。ソフトアガー"上"に液体培地とともに撒いてみたこともあるのですが、私の使った細胞はアガーにほとんど固着せず浮いたままでした。

(無題) 削除/引用 No.1549-3 - 2008/07/12 (土) 12:49:36 - ~ これは、ソフトアガー"上"からのクローニングでしょうか？ それとも、ソフトアガー"中"からのクローニングでしょうか。 ソフトアガー"上"であれば、 イエローチップや竹串などで回収していました。 株によっては、ソフトアガー"上"とソフトアガー"中"で、 コロニー形成能が変わるようです。

(無題) 削除/引用 No.1549-2 - 2008/07/12 (土) 12:33:07 - おお >[Re:1] yukiさんは書きました : > 動物細胞をsoft agarまたはsoft agaroseで足場非依存的に培養し、クローニングする方法について教えてください。文献やインターネットでは、このクローニングは可能という意見と不可能という意見に分かれます。可能という人は、200マイクロリットルピペッターを使用して顕微鏡下に単一コロニーを吸引採取するとのことですが詳細は不明です。 えっと、200ulのぴペッターを使うのですが、チップは200ようのやつの先から1cmぐらいをカットしたような、吸口の幅の広いものを使うと良いと思います。そういうのが売っていますし、ま、自分でカットしても良いかと思います。コロニーは肉眼で見えるくらいの大きくなってから取ることも結構多いようです。 200ulのぴペッター出なくてもパスツール見たいなピペットで先の太いものを使えばできると思います。がん遺伝子を取るのにこの手のコロニーのクローニングは欠かせない方法だったように思えます。 私も0.4%アガロース（Invitrogen UltraPure Agarose）にて試みたのですが、うまく採取できず、採取できても細胞がアガロースから脱出できないのか刺激で死んでしまうのか、液体培地で増殖させることができませんでした。細胞はヒト乳腺上皮細胞株MCF10Aをトランスフォームしたものを使用しました。 > > この実験の経験がある方がいらっしゃれば、実験方法と使用したsoft agar(ose)の種類・濃度をご教示いただけますと幸いです。よろしくお願いします。 濃度ははっきりとは覚えてませんが、0.4%ぐらいだったと思います。実験にはほとんど影響ないと思いますが、アガロースといえるほどピュアー出なくて良いようです。細胞培養用のアガーとかうってますし。バクテリア用のが使えるかは分かりませんが、、、アガロースと培養用アガーで値段的にどちらがいいかも分かりませんのでどちらをすすめるということでもないのですが、、、、

soft agar(ose)からの動物細胞のクローニング 削除/引用 No.1549-1 - 2008/07/12 (土) 06:53:45 - yuki 動物細胞をsoft agarまたはsoft agaroseで足場非依存的に培養し、クローニングする方法について教えてください。文献やインターネットでは、このクローニングは可能という意見と不可能という意見に分かれます。可能という人は、200マイクロリットルピペッターを使用して顕微鏡下に単一コロニーを吸引採取するとのことですが詳細は不明です。私も0.4%アガロース（Invitrogen UltraPure Agarose）にて試みたのですが、うまく採取できず、採取できても細胞がアガロースから脱出できないのか刺激で死んでしまうのか、液体培地で増殖させることができませんでした。細胞はヒト乳腺上皮細胞株MCF10Aをトランスフォームしたものを使用しました。 こういうクローニングの目的ではメチルセルロースを使用するのが一般的とは思いますが、細胞の増殖特性がsoft agaroseと異なるようなのでできればsoft agaroseで試みたいのです。 この実験の経験がある方がいらっしゃれば、実験方法と使用したsoft agar(ose)の種類・濃度をご教示いただけますと幸いです。よろしくお願いします。

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