全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ugg shoes 削除/引用 No.1546-16 - 2010/08/19 (木) 16:57:26 - ugg shoes 水はバッファー効果がありませんので、あなたの溶かしたサンプルのpHがサンプル間で一緒とは限りません。また、ISOGENやTRIZOLなどと場合特に酸性の状態からイロプロパノールで沈殿させますので、実際の次のステップに問題ないぐらい微量な酸性の物質の持ち込み(酢酸とか)でも、水に溶かしてしまうと酸性に偏ってしまいます。次のステップに問題ないですし、RNAは酸性の方が安定ですのでそれはそれで構わないのですが、UV領域の吸収は酸性側と中性(実際はアルカリ側でODを測ることが多い)で可也違ってきます。260/280はアルカリ側で測った方が高くなりますし、その値を基準にしているのが現状です。ですから、吸収の様に取ったサンプルはTEなどで2×希釈して測るなどして、pHの安定した状態で測るのがベターだと思います。http://www.uggs-hot-boots.com/ugg-classic-cardy-boots.html

(無題) 削除/引用 No.1546-15 - 2008/07/22 (火) 09:00:05 - isa ありがとうございます。TEで溶かしもて260の吸光度は変わらずに、ＯＤ比だけ高くなるようですね。

(無題) 削除/引用 No.1546-14 - 2008/07/21 (月) 13:13:50 - AP >モレクロにも載ってますかね、、、 Molecular Cloning (3rd edition)のAppendixに核酸の定量の項があり、定量法の一覧を示したテーブルのコメント欄に 「正確に定量するには、pHを注意深くコントロールし、イオン強度は低くする必要がある」と書かれていました。具体的にどうしたらよいかという記述はないですが、先ほど示した論文がリファレンスに挙げれられています。

(無題) 削除/引用 No.1546-13 - 2008/07/21 (月) 10:17:00 - AP >PH＝８くらいのbufferでRNAは吸光度を測定しなければならないという事実は、教科書などを探しても見当たらないのですが、どこにのっていませんでしょうか？ この論文を見てください。無料登録で全文読めます。 http://www.biotechniques.com/default.asp?page=article_archive&subsection=article_display&year=1997&issue=3/1/1997&id=31199727

(無題) 削除/引用 No.1546-12 - 2008/07/20 (日) 18:31:16 - おお > PH＝８くらいのbufferでRNAは吸光度を測定しなければならないという事実は、教科書などを探しても見当たらないのですが、どこにのっていませんでしょうか？ わたしは、カレントプロトコール(赤いファイル形式になったやつ)でよんだと思います。 モレクロにも載ってますかね、、、

皆様ありがとうございます 削除/引用 No.1546-11 - 2008/07/20 (日) 17:54:26 - isa PH８のTEbufferにて吸光度を測定しなおしたところ、OD比は2.2程度となりました。全体的に吸光度が低い値になっていまい、濃度もうすくなる結果となってしまいましたが・・・・ おそらく今まで、２マイクログラムのRNAをrealtime RT PCR反応に用いていたのですが、水で測定した吸光度のため濃度が高くでており、2マイクログラムより少ないRNAでrealtimeしていたのだと思います。 最終的にはGAPDHで補正していたので、結果には影響なかったとは思いますが 。 PH＝８くらいのbufferでRNAは吸光度を測定しなければならないという事実は、教科書などを探しても見当たらないのですが、どこにのっていませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1546-10 - 2008/07/13 (日) 17:24:20 - AP 吸光度を測るときは通常、少量のサンプルをセルの体積に合わせて希釈して行うと思います。このときの希釈を水でなく、pH 8くらいのバッファーでやればいいと思います。もちろん、ブランクはそのバッファーでとります。 Ratio 1.6と1.7では誤差範囲でしょう。純度の高いRNAの場合ratio 2.0だといわれています（二本鎖DNAは1.8）。

(無題) 削除/引用 No.1546-9 - 2008/07/13 (日) 17:10:08 - おお >[Re:8] isaさんは書きました : > おおさん＞ > ありがとうございます。 > > 教えていただきたいのですが、最終的にできたRNAペレットをTEで溶かしたほうがよいのですか？それとも吸光度計に用いる場合もTEのほうがいいのですか？ これは、そのあと何をするかにもよるかもしれませんが、たいていの場合どちらでもいいです。科学的というより好みとか、あとはRNaseフリーの水とTEどちらが手に入りやすいか、または作りやすいかなど研究室の環境によると思います。で今まで水でやってらっしゃるようなのでこれからも水で溶かした方がトラブルがあるよりいいかと思います。ただし、OD測定用に取ったRNAはTEに希釈して測るようにすればいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1546-8 - 2008/07/13 (日) 16:44:00 - isa おおさん＞ ありがとうございます。 教えていただきたいのですが、最終的にできたRNAペレットをTEで溶かしたほうがよいのですか？それとも吸光度計に用いる場合もTEのほうがいいのですか？ いつもは、最終ペレットを水20マイクロリットルでとかす→そのうち1マイクロリットルをとり水49マイクロリットルにとかす→これを吸光度計で測定する。というようにしているのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.1546-7 - 2008/07/13 (日) 15:36:06 - おお >[Re:6] isaさんは書きました : > ありがとうございます。 > ＲＮＡでＯＤ比を測定するのは蛋白の混入などが起こってないことを確認すると思っておりましたが、ＲＮＡペレットを溶かすBufferによってOD比が変わってくるとすると、OD比を測定する意義はなんなのでしょうか？ 意義はもちろんタンパクやその他のものの持ち込みをチェックするためですよ。もともと弱アルカリの条件でOD値を測ったもので基準を作ってます(きれいなRNAのOD比は2ぐらい、で低くなるとタンパクなどのコンタミが考えられるとかいう基準です)ので、その基準にあわせて測らないと意味がないと言う事です。

(無題) 削除/引用 No.1546-6 - 2008/07/13 (日) 14:35:44 - isa ありがとうございます。 ＲＮＡでＯＤ比を測定するのは蛋白の混入などが起こってないことを確認すると思っておりましたが、ＲＮＡペレットを溶かすBufferによってOD比が変わってくるとすると、OD比を測定する意義はなんなのでしょうか？ 結局RNA溶液の濃度さえ分かれば、RT-PCRはできますので・・・

(無題) 削除/引用 No.1546-5 - 2008/07/13 (日) 02:04:02 - おお 水はバッファー効果がありませんので、あなたの溶かしたサンプルのpHがサンプル間で一緒とは限りません。また、ISOGENやTRIZOLなどと場合特に酸性の状態からイロプロパノールで沈殿させますので、実際の次のステップに問題ないぐらい微量な酸性の物質の持ち込み(酢酸とか)でも、水に溶かしてしまうと酸性に偏ってしまいます。次のステップに問題ないですし、RNAは酸性の方が安定ですのでそれはそれで構わないのですが、UV領域の吸収は酸性側と中性(実際はアルカリ側でODを測ることが多い)で可也違ってきます。260/280はアルカリ側で測った方が高くなりますし、その値を基準にしているのが現状です。ですから、吸収の様に取ったサンプルはTEなどで2×希釈して測るなどして、pHの安定した状態で測るのがベターだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1546-4 - 2008/07/12 (土) 21:11:56 - とも 水ではなくHEPSやリン酸バッファーにとかで溶かせば2.0近くになりますよ。しかし、水で溶かしてもその後RT-PCRをやるなら全く問題はありません(経験で）。

(無題) 削除/引用 No.1546-3 - 2008/07/12 (土) 20:41:16 - ISA ありがとうございます 滅菌水にとかしているんです。ＰＨの変動というのはどういうことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1546-2 - 2008/07/11 (金) 19:27:05 - ~ 書いてあるとおり”水”に溶かしているのであれば、 pHの変動による影響を受けていませんか？ 4時間前にも同様の書き込みを受けていませんか？ 水ではない溶媒に溶かしているのであれば、まずはそこから情報を出しましょう。

RNAのＯＤ比 削除/引用 No.1546-1 - 2008/07/11 (金) 19:18:13 - isa 培養細胞がらISOGENでRNAを回収し、その濃度を吸光度計で測定しています。 RNAペレットを水で溶解したあと、その一部をとり吸光度計で測定しています。 2年前くらいから同じようにやっているつもりが、最近どうしてもOD比（260/280）が1.6をきってしまいます。 変だなと思い、一旦RNAを-80度で凍結したあと、RT反応のために融解させたときにもう一度測定してみますと、今度はOD比が1.7くらいでよい状態になっているのです。毎回同じようなことが起こります。 何か原因として考えられるものはありませんでしょうか？

全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---