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(無題) 削除/引用 No.1542-12 - 2008/07/14 (月) 19:42:50 - seventh SYBRを使ったリアルタイムではテンプレートを含まないネガコンでも蛍光強度が30サイクル以降で増加してくることがあります。主な原因はプライマーダイマーだと思われます。 融解曲線を見れば、特異的な産物かそうでないかはわかると思います。 ただしゲノムがコンタミしていて増幅される領域がイントロンを含む（ターゲットと異なる配列が増幅される）場合は融解曲線のTmでは判別できないです。

(無題) 削除/引用 No.1542-11 - 2008/07/14 (月) 11:17:13 - Genome う〜んとさん お返事ありがとうございます。う〜んとさんは、Total RNAを何μgで何volumeのcDNAを合成して、ハウスキーピング遺伝子と自分の調べたい遺伝子の段階希釈をどのくらいにしてリアルタイムPCRを行っていますか？教えて頂けないでしょうか？ 〜さん 〜さんの言っているとおりにやってみたいと思います。また、やって結果がわかれば、また、お知らせしたいと思います。 APさん rDNAはゲノム中に多コピー（数百コピー）あることやイントロンがないことを知りませんでした。私の勉強不足でした。教えて頂きありがとうございました。とても勉強になりました。 おおさん 少し長めのプロダクトができるようにするとは、どのようにすればいいのでしょうか？教えて頂ければありがたいです。 皆様、聞いてばかりで申し訳なく思います。RNA初心者で、周りに聞ける人がいないため、知らないことばかりですみません。今、私の研究室では、私一人でリアルタイムPCRを立ち上げてる段階です。(それを言い訳にしてはいけないと思いますが・・・)

(無題) 削除/引用 No.1542-10 - 2008/07/12 (土) 12:46:58 - おお インターナルコントロールとして量が定められるのであれば、サイクル数のあとの方でたしょう増えても大丈夫ではないでしょうか。RT-で検出される量が1/10以下であれば、半定量的な測定はじゅうぶん成り立ちますし。25サイクルで十分量が測定できるなら30回す必要性も感じませんし、、、 ただ、手持のプライマーとか水とかバッファーとかなどにコンタミがあるのはさけたいとは思いますが。 rRNAは確かにイントロンがない(動物しか知りませんが)と思います。そこでプライマーを工夫するのはちょっと難しいかなと。ただ、少し長めのプロダクトができるようにすると、ゲノムのコンタミの増幅する可能性を下げれると思います。qPCRなので限界はありますが、、、、

DNaseIで一本鎖DNA消化 削除/引用 No.1542-9 - 2008/07/11 (金) 23:21:06 - う〜んと ~さん、ご指摘ありがとうございます。 なんでか、そう思い込んでました。 １／５０から１／５００くらいの活性はあるようですね。 http://www.ambion.com/jp/techlib/tips/dnase1demystified.html 通常使う酵素量であれば、大丈夫なようです。

(無題) 削除/引用 No.1542-8 - 2008/07/11 (金) 21:58:35 - AP rDNAはゲノム中に多コピー（数百コピー）あるので、シングルコピー遺伝子ならネガティブになるようなDNase処理でも、十分でない可能性はあると思います。 また、rRNAにはスプライシングはないので、イントロンを挟むという手ははなから無理です（種類の異なるrRNAがpolycistronicに転写されて切り分けられるプロセッシングや、自己相補性で二次構造を作った時にニックが入ったりはあったかもしれない）。 QiagenやAmbionなどのイオン交換カラムを使うタイプの精製なら、DNAを効果的に排除できる可能性はあります。 また、以前のトピでDNase処理にMg++に加えCa++を添加すると効果的に消化できるという論議がありました。

(無題) 削除/引用 No.1542-7 - 2008/07/11 (金) 21:27:32 - ~ このサンプルは複数あるのですか？ あるのであれば、テンプレートのcDNA以外は酵素やプライマーなど全部を混ぜたプレミックスを作りますよね。 それを1サンプル分多く作っておいて、 テンプレートを入れずにPCRにかけると、 テンプレートが何も入っていないので、30サイクル以上まわしてもなにもでないはずですよね。 ただ、試薬やピペットマンが汚染していることが原因で、 30サイクル以上まわしたRT-のサンプルにバンドが出てくるのであれば、 テンプレート無しのサンプルでも同様にバンドが出てきます。 このテンプレート無しのサンプルが増えずに、 RT-のサンプルでバンドが増えてくるのであれば、 サンプル中のDNAのコンタミが原因だと分かります。 ほとんど手間がかからずに、原因の切り分けが可能です。 私がやっていたのは単なるゲノミックPCRでしたが、 テンプレート無しでもバンドが出たときがあり、 フィルター付きチップを使うことで解決したことがあります。 > う〜んと さん http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/18068-015_001.shtml では、一本鎖DNAも分解できるように書いてありますが、 RT−PCRの条件では一本鎖DNAは分解しないのですか？

(無題) 削除/引用 No.1542-6 - 2008/07/11 (金) 20:29:30 - う〜んと 植物の茎頂部って分裂組織ですよね？ 一本鎖DNAがたくさんあると仮定したらDNaseIでは分解できませんから、RTしていないコントロールで増えても不思議はないですね。 rRNA遺伝子はたいていの生物でゲノム上に100コピーとか持ってると思うので、なおさらな気がします。 DNAの持ち込みを減らすには使うRNAの量を減らすのも解決法の一つではないでしょうか。 45ngを使った場合に30サイクルでネガコンが増えてしまうのなら、1ngくらいにすれば35サイクル以降になるはずですね。 これくらいだと条件次第では鋳型がなくても増えることがあるので、現実的にはネガコンとして扱えると思います。 姑息かな（笑） 余談ですが、コピー数の少ない遺伝子の検出目的でも45ngは多すぎる気がします。

(無題) 削除/引用 No.1542-5 - 2008/07/11 (金) 19:37:46 - Genome 皆さん、すみません。RTなしのcDNAで18SrRNAを増幅しています。 Pumpkinさん 反応液を調製すると書いていますが、どのような意味でしょうか？誠に申し訳なく思いますが、教えて頂けないでしょうか？ 〜さん 確認する方法があったら教えて頂けないでしょうか？ UCさん 植物の茎頂からCTAB/NaCl法で抽出しています。

Re: 削除/引用 No.1542-4 - 2008/07/11 (金) 17:10:34 - UC 　元々の試料は何で、どういう手法でRNA抽出しているのでしょうか。血液とかだと培養細胞やPBMCなどに比べれば、それなりのgenomic DNAのコンタミがあります。なので元々のコンタミが相当量だと、DNase処理しても残存する可能性も否定出来ません。 　この場合のネガティブコントロールというのは、RTなしのcDNAということですよね？ 18S rRNAは、相当リッチなので、系にもよりますがテンプレート量が45ngってちょっと多い気もします(それでも30サイクルで出てくるってことは、それなりの量ですよね･･･)。 ＞プライマーは、ゲノム情報がわかっていないため、イントロンを挟む領域では作れていません。 とのことなのでヒトではないんでしょうね。イントロンを挟んで設計するのがベターとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1542-3 - 2008/07/11 (金) 14:19:40 - ~ どれかの試薬やピペットマンがコンタミしていて、 同じプレミックスで作成したテンプレート無しでも増えたりしませんか？

(無題) 削除/引用 No.1542-2 - 2008/07/11 (金) 14:14:43 - Pumpkin >18S rRNAを増幅していますが、30サイクル以降から、ネガティブコントロールで増幅が確認 ネガコンとは、RTかけずに18s RNAをPCRで見ているってことですか...。DNase�T処理はうまくいっているのですよね。2回もしているのにうまくいかないって、反応液はちゃんと調製されていますよね。

ゲノムのコンタミ 削除/引用 No.1542-1 - 2008/07/11 (金) 11:42:46 - Genome 質問したいことがありメールしました。Total RNA3μgからゲノムを除去してreal time PCRを行っています。 DNase処理は２回行った後，Total RNA 450ngを使ってcDNA(20μl volume)を合成し、1/10希釈で18S rRNAを増幅していますが、30サイクル以降から、ネガティブコントロールで増幅が確認されてしまいます。ゲノムのコンタミを防ぎたいのですがどのようにすればいいのでしょうか？どなたかいい方法を知っていれば教えてください。ちなみに、プライマーは、ゲノム情報がわかっていないため、イントロンを挟む領域では作れていません。

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