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Re: 削除/引用 No.1533-9 - 2008/07/17 (木) 20:00:02 - UC RNAの取得が目的なら、トリゾールを加えた状態で-80℃に保存が良いでしょう。この状態で、最低でも数ヶ月は持つと思います。

(無題) 削除/引用 No.1533-8 - 2008/07/17 (木) 19:23:24 - 細胞 すいません。あと一点教えてください。 トリゾールで抽出する際、抽出工程を後日行いたいときにはどこで止めればよいですか？ 細胞をプレートからエッペンなどに移して凍結保存、 もしくは遠心してメェデウムをすててトリゾールを加えた状態で凍結 どちらがよいのでしょうか。それともこの保存法ではいけないでしょうか？教えてください

(無題) 削除/引用 No.1533-7 - 2008/07/12 (土) 12:20:20 - おお > お聞きしたいのはRNA抽出の手技についてなのですが、QIAGENやROCHEのRNA抽出カラムを用いて抽出を行ったのですが収量が非常に悪く困っております。 > トリゾールを使うことも考えたのですが、一般的に手技のミスによるロスがなければカラムを使うのとトリゾール、クロロホルム法ではどちらが効率よく抽出できるものなのでしょうか？ > > また現在は最終濃度２×10　６乗　個で６WELLで培養しております（細胞数も増加しているのですが）。96WELLでもRNA抽出はできるものなのでしょうか？ > ２×10　６乗で0.5ugは普通の培養細胞(株化した細胞)ではひとケタぐらい収量が少ないと思います。プライマリーの培養でどの程度あてはめれるかというのはありますが、少ないという印象はあります。もし、２×10　６乗個を6wellにまいているならちょっと多すぎと思いますが、、、 収量が少ないというのはカラムのせいというより、何かほかのところにあるかもしれません。RNAは分解してたりしてませんよね。あるいは細胞の調子がよくない(増えていたとしても)とか、全体をチェックした方がいいように思えます。 単純に同じサンプルをカラムとトライゾールで比較するときに少し問題が生じます。カラムだとtRNA、miRNAや5srRNAを回収できません。意外とこのフラクションの量は大きいと思います。トライゾールはこのフラクションまで回収できますので、収量が幾らか多いからといって目的のものが多く取れているとは限りませんね。 96wellということですが、ちょっと少なく扱いにくいかなと思います。0.5mlぐらいの培養なら感覚的に何とかなるような気がしますので、それをもとに考えると48か24wellなら何とかなるかなという感覚ですね。QIAGENのmicrokitでこなせるスケールかと思います。 ちなみの1x10^5個の培養細胞(株化した細胞)ならこの手のキットで1ug程度の収量という情報がQIAGENで示されていたと思います。

(無題) 削除/引用 No.1533-6 - 2008/07/12 (土) 01:19:22 - TＸ 基本的にキットとマニュアル（トライゾル）を比較すると 収量　マニュアル＞キット 純度　キット＞マニュアルですね。 > 前回カラムで抽出した時は0.5μｇくらいしかとれませんでした。 そんなもんじゃないでしょうか。 そんなにRNAいりますか？ 昔、リンパ球使って実験していたときは RNA100ngからcDNAを作製して PCRに用いていましたよ。

Re: 削除/引用 No.1533-5 - 2008/07/11 (金) 23:54:45 - UC >数えたほうがよいのでしょうか？ どれくらい増えるか分かっているなら毎回計測することもないと思いますが、もし情報がないなら数えてみたくなりません？ トレパンブルーで見れば、どれくらい死んでるかも分かりますし。刺激後の細胞形態も見たくなりますよね。 スタートが2Mであれば、RNA抽出は十分にいけるでしょうね。細胞を遠心した後、pelleteが余裕で目視できる量です。最低RNA 10μgは期待出来ます。 >WELL中の培養液を遠心、ペレットをPBSで洗浄 >トリゾール1ml（？）に溶かして注射器でホモジネート Invitrogenのマニュアルには、浮遊細胞系からの処理の項目にこう書いてます。 Washing cells before addition of TRIZOL Reagent should be avoided as this increases the possibility of mRNA degradation. 自分の場合、新鮮な培養細胞であれば、遠心後、上清をdecantした後は、直接Trizolを1mL加えて、1000Pピペットでホモジェナイズしてます。7-10回前後のピペッティングで、ほぼpelleteが見えなくなります。PBSでのwashは、細胞に余計なストレスを掛けると思うのでしません。凍結保存した細胞を融解してトリゾール処理するときは、DMSOを除きたいので、室温の無血清培地で1回だけwashしますが。 注射器って針付きですか？通常のピペッターで十分ですよ。23G針とかだと、RNAもDNAもズタズタになりそうな･･･、分かりませんが。

(無題) 削除/引用 No.1533-4 - 2008/07/11 (金) 21:04:03 - 細胞 ありがとうございます。 刺激前の細胞濃度を２x10^6個にあわせてその後２４時間刺激しています。ＲＮＡ抽出前の細胞の個数は数えていないです。数えたほうがよいのでしょうか？ 前回カラムで抽出した時は0.5μｇくらいしかとれませんでした。 6wellの場合であれば１WELLにだいたい液量は何μLくらい入れるのがよいのでしょうか？ トリゾール法は具体的には、 　　WELL中の培養液を遠心、ペレットをPBSで洗浄 　　トリゾール1ml（？）に溶かして注射器でホモジネート 　　あとは組織からの抽出と同じ過程でクロロホルム、エタ沈など でよいのでしょうか？

Re: 削除/引用 No.1533-3 - 2008/07/11 (金) 04:52:13 - UC 専らトリゾールを使っていますが、培養細胞（血球系の浮遊細胞でも）であれば、大体1x10^6個の細胞から最低でも5μgの、非常に高純度のトータルRNAが取れてます。「収量が非常に悪い」とは具体的にどれくらいの量なんでしょうか。 あと、「最終濃度２×10　６乗　個」というのがよく分からないのですが、結局、RNA抽出時の細胞数はどれくらいですか？ 96 wellでのRNA抽出はやったことないですし、やりたくもないですねぇ、煩雑そうで。6-wellあるいは24-well(この場合は数well分を1サンプル)で十分だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1533-2 - 2008/07/10 (木) 21:51:13 - えっと stratageneのスピンカラムのdata sheetには１個の細胞からもこれさえ使えばRNA抽出出来ますと書かれてあります。 96穴か〜、感覚的に難しそうですね、。

培養細胞からのRNA抽出方法について 削除/引用 No.1533-1 - 2008/07/10 (木) 21:28:41 - 細胞 最近細胞培養をはじめた素人です。胸腺やリンパ節などから細胞を抽出し、LPSなどで24Hで刺激を加えてrealtimePCRやELISAなどを行おうとしているところです。 お聞きしたいのはRNA抽出の手技についてなのですが、QIAGENやROCHEのRNA抽出カラムを用いて抽出を行ったのですが収量が非常に悪く困っております。 トリゾールを使うことも考えたのですが、一般的に手技のミスによるロスがなければカラムを使うのとトリゾール、クロロホルム法ではどちらが効率よく抽出できるものなのでしょうか？ また現在は最終濃度２×10　６乗　個で６WELLで培養しております（細胞数も増加しているのですが）。96WELLでもRNA抽出はできるものなのでしょうか？ 培養の素人ですので初歩の初歩のことではあると思いますが教えてください

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