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(無題) 削除/引用 No.1529-5 - 2008/07/12 (土) 17:33:00 - ats NUNC社のImmnobilizer plateは、共有結合で固定でき（固相化した抗体がdetergentで剥がれない）、かつ表面が親水性なのでバックグランドが低くくお奨めです。 StripWell（8 well)タイプもあり、無駄になりません。

(無題) 削除/引用 No.1529-4 - 2008/07/11 (金) 13:15:00 - おお バッファーにデタージェントを入れてみるとか、あとELISA用プレートは、非常に強い吸着性を持つものから、バックを抑えるための少し吸着性を加減しているものまでピン切りです。業者にいってどれがいいか試すということでサンプルをもらって、ベストのものを使うというのも考えられますね。

CTGFの測定-1 削除/引用 No.1529-3 - 2008/07/10 (木) 17:51:40 - CTGF お返事ありがとうございました． いろいろ書き足りない点がありました． 1)ELISAは，サンドイッチELISA法です 2)抗体ですが，二次抗体は，一次抗体のビオチン化したものを使用しています． 3)ブロッキング剤は，IMMUNO-TEK　ELISA　Construction　System中のBepto　Blockです． 4)参考にした文献は， �@Experimental　EYE　Research，78(2004)，1127-1136，Timothy です． 内容は以下のとおりです． T.D.Blarock et al./Experimental Eye Research 78 (2004) 1127-1136 Flatt-bottom ELISA plate(96well) 50μL, goat anti human CTGF antibody (10μg/mL in PBS/0.02%sodiumazide)でコートする.1hr,37℃ Well洗浄，4回 300μL，blocking　buffer(PBS/0.02%　sodium　azide/1%bovine serum albumin),1hr,RT Polyclonal anti bodyは，rat　CTGFを検出に適している．なぜならば，ratとhumanのCTGFペプチドのN末端の半分のアミノ酸配列はratのそれと92%の相同性がある． Well洗浄，4回 50μL，リコンビナントhumanCTGFタンパク(0.1-100ng/mL)あるいはサンプルをwellに添加し，1hr,RT Well洗浄，4回 50μL，biotinylated goat anti-human CTGF(2μg/mL)を添加し，1hr，RT，暗所 Well洗浄 50μL，alkaline phosphatase-conjugated streptavidin(1.5μg/mL, Zymed,South　SanFrancisco,CA,USA)，1hr,RT Well洗浄 100μL, alkaline phosphatase Substrate solution(1mg/mL,p-nitrophenyl phosphatase，Sigma Chemicals,St Louis,MO,USA) (sodium carbonate/bicalbonate　buffer/0.02%sodium azide,pH9.6) 405nmで測定 5)先にも書きましたが，ビオチン化抗体の非特異的吸着が起こっていると思います． アドバイスお願いいたします．

(無題) 削除/引用 No.1529-2 - 2008/07/10 (木) 15:47:57 - sea CTGFさんの文章の中にあるいくつかの根本的な疑問は、 どのELISA法なのか？(サンドイッチ法、とか) ということです。それから、 > 2)一次抗体，二次抗体を文献ではgoat-anti　human　CTGF　antibodyを用いていますが，rabbit-anti　human　CTGF　antibodyを使用した点 一次抗体･二次抗体を同じものを使っているわけじゃないですよね？ ここがよく理解できません。 それともこれはサンドイッチ法でのcapture antibodyとかのことですか？ さらに > 文献と異なる所は， と言われても、その文献がわからないのでは系が理解できませんが・・ この範囲で言えることを書くと、 (1) ブロッキングは何を使っているのか？ ミルクだったらバックあがりそうですが。 (2) ビオチン化抗体の非特異的吸着は抑えられているのか？ ELISA用のプレートを使っているので普通は最小限なはずの気がしますが。 でもまあ適切なブロッキング剤を十分量使ってブロックしないと まずいですよね。 あと上記の疑問点について書かれるともう少し具体的なアドバイスが 誰かから期待できそうですね (^-^)/

CTGFの測定 削除/引用 No.1529-1 - 2008/07/10 (木) 13:57:09 - CTGF CTGFを測定するために，ELISA　plateを作成してみました． 文献によると，0.1ng/mLから100ng/mLの範囲で定量可能とありますが，検量線を測定してみたところ，blankの吸光度が高く，100ng/mLから1000ng/mLの範囲でしか，濃度依存的な吸光度の増加が認められませんでした． 少し検討してみたところ，作製したplateに，CTGFは添加せず，ビオチン化抗CTGF抗体を添加すると高い吸光度が認められました． blank吸光度が高い原因について教えてください． 文献と異なる所は， 1)ELISA　plateの作成に　IMMUNO-TEK　ELISA　Construction　Systemを使用した点 2)一次抗体，二次抗体を文献ではgoat-anti　human　CTGF　antibodyを用いていますが，rabbit-anti　human　CTGF　antibodyを使用した点 3)plateに添加する一次抗体の濃度を文献では10μg/mLですが，2.5μg/mLにした点　 です． これらのことが原因でしょうか？ 何か，別の要因でしょうか？対処法などございましたら， ご教授お願いいたします．

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