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リアルタイムＰＣＲの反応条件について トピック削除
No.1526-TOPIC - 2008/07/09 (水) 23:15:09 - real time 初心者
　現在stratagene Mx3000PにてQiagen SYBR を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行っております。反応条件（温度ではなく時間）について質問があります。
　現在1cycleを　denature、annealing、extension、95℃60s 58℃60s 72℃60sで行っております。当方初心者なもので現在のラボで伝統的にこのサイクルで行っていたものにしたがったものですが、Qiagenのinstructionにはそれぞれ15ｓ、30ｓ、30ｓ、となっておりますし、文献をみてもこれほど長くまわしているものはほとんど見当たりません。両方ためしてみましたが、検量線を引いたときのデータのばらつき、直線性、増幅効率などは長くまわしたほうが、きれいなデータがでます。幸い非特異的増幅はおこりませんでした。 結果オーライでこのまま突き進んでもいいかとおもいましたが、将来的にpaperとなったときにあまりに非常識な反応条件だとまずいのではないかと思い質問させていただきました。 基本的には試薬の instructionに従うべきなのでしょうか。
（ちなみに現在Qiagenをつかっていますが、stratageneのＳＹＢＲでは30ｓ60ｓ60ｓ(or 30s)と比較的長い設定となっていますし、ＰＣＲ機のデフォルトもそのようになっておりす。
温度設定も含めいろいろためして最適な条件をみつけるのがベストなのはわかっていますが、上記の方法でよい検量線がひけたので、またプライマーの種類も多いためやり直すのを躊躇しているものですから質問させていただきました。）

焦点のぼけた質問で申し訳ありませんが、ご意見うかがえると幸いです
　
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ありがとうございました 解決済み 削除/引用
No.1526-6 - 2008/07/10 (木) 22:45:01 - real+time+初心者
皆様、早速のご返事ありがとうございました。
denature時間に関しては私もいくらなんでも長すぎるのでは
とおもっておりました。そのほかついては基本的にはいいデータが得られて
いれば、そこであまり悩む必要はないということですね。
ありがとうございました。
これで解決とさせていただきます。

皆さまに同意。 削除/引用
No.1526-5 - 2008/07/10 (木) 13:38:12 - mom-a
2minとか3minとかになると、さすがに非常識の範疇に入りそうな気がしますが、60secなら問題ないと思います。

仮に、「長すぎないか？」という指摘をうけたとしても、データのばらつき、直線性、増幅効率がきちんとしているという結果を示せるのですから心配しなくて大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用
No.1526-4 - 2008/07/10 (木) 12:54:32 - おお
検量線がひけて、系がなりたっているのであれば、それでいいとおもいます。

denature、annealing、60s は確かに長いと思いますが、変えて検量線が引けなくなってしまうのは最悪です。

(無題) 削除/引用
No.1526-3 - 2008/07/10 (木) 11:32:53 - AP
酵素やターゲットやプライマーが違えば、サイクルの条件が違うでしょうし、それらが同じでも、使う機器によって最適条件が違う可能性はあります（おそらく各社ともプロトコールは自社ブランドの試薬と機器の組み合わせが基本でしょう）。
データをとったのが最適条件であるかどうかまで突き詰めようとすればきりがないでしょう。
最適条件ではないとしても、こういう反応条件や機種でデータを取りましたということを書けば、第三者にも再現実験が出来るわけですから、だれも文句は言わないと思います。

ただ、95℃, 60 secは長すぎると思います。このような高温にさらす時間が長いほど酵素の失活が早まりますし、PCR産物はごく短いものでしょうから、短時間でも十分に解離するはずです。

伸長反応時間はターゲットの長さによるでしょうけれど、インターカレーターが入っていると、アニーリングや伸長を阻害する可能性があるので、通常のPCRよりやや長めになっているのは故なきことではないと思います。

Re: 削除/引用
No.1526-2 - 2008/07/10 (木) 08:53:23 - UC
PCRは、ちゃんとワークするプライマーなりTaqがあって、温度や塩濃度とかも適切であれば、各反応時間が大きくずれようがかかるものです。個人的には、denatureの時間は15-30sあたりが妥当とは思いますが、その他は、ベターな結果が出てるのであれば、それでいいんじゃないでしょうか。

＞現在のラボで伝統的にこのサイクルで行っていた

とのこと。以前からなら、その条件であなたのラボが出した論文とかありそうですが。また、別に試薬のマニュアル通りでないからと突っ込まれることもないのでは。PCRに関しては。

リアルタイムＰＣＲの反応条件について 削除/引用
No.1526-1 - 2008/07/09 (水) 23:15:09 - real time 初心者
　現在stratagene Mx3000PにてQiagen SYBR を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行っております。反応条件（温度ではなく時間）について質問があります。
　現在1cycleを　denature、annealing、extension、95℃60s 58℃60s 72℃60sで行っております。当方初心者なもので現在のラボで伝統的にこのサイクルで行っていたものにしたがったものですが、Qiagenのinstructionにはそれぞれ15ｓ、30ｓ、30ｓ、となっておりますし、文献をみてもこれほど長くまわしているものはほとんど見当たりません。両方ためしてみましたが、検量線を引いたときのデータのばらつき、直線性、増幅効率などは長くまわしたほうが、きれいなデータがでます。幸い非特異的増幅はおこりませんでした。 結果オーライでこのまま突き進んでもいいかとおもいましたが、将来的にpaperとなったときにあまりに非常識な反応条件だとまずいのではないかと思い質問させていただきました。 基本的には試薬の instructionに従うべきなのでしょうか。
（ちなみに現在Qiagenをつかっていますが、stratageneのＳＹＢＲでは30ｓ60ｓ60ｓ(or 30s)と比較的長い設定となっていますし、ＰＣＲ機のデフォルトもそのようになっておりす。
温度設定も含めいろいろためして最適な条件をみつけるのがベストなのはわかっていますが、上記の方法でよい検量線がひけたので、またプライマーの種類も多いためやり直すのを躊躇しているものですから質問させていただきました。）

焦点のぼけた質問で申し訳ありませんが、ご意見うかがえると幸いです
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