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(無題) 削除/引用 No.1524-7 - 2008/07/10 (木) 13:40:09 - おお もうちょっと幅をひろげて、実験した方がいいかと思います。まず局在を見てみてはどうでしょうか、その違いは糖鎖などの違いがある可能性を示唆しているかもしれません。 シグナルペプチドが機能していないならERから、シグナルペプチドを介したタンパクの合成経路を介していない可能性がありますよね。そうするとERないで行われる糖鎖付加は行われてないかもしれません。そのた、シグナルペプチドを介したタンパクの合成経路を介していても局在が違うときは、途中の糖付加プロセッシング異常の可能性も考えられます。 一番よくわかっている糖鎖付加は、ドリコールにあらかじめ付加された14個ぐらいの単糖からなる糖鎖を、シグナルペプチドをかいしてER内に運び込まれた時に、付加するというものです。シグナルペプチドの異常と考えると非常にこの辺は興味がわくのではと思います。 もし両者(正常、変異体)が細胞表面で発現しているなら、細胞表面をプロテアーゼで処理することにより、膜に正しく挿入されているか分かる可能性もあります。というのは、シグナルペプチドが全く機能してないのなら、サイトゾルで作られて、疎水性の強い部分が無秩序に膜に食い込んで入る可能性もあるかもしれないと思えるからです。 糖が一番怪しいですけど、その他の修飾、プロセッシングの可能性もあるともいます。幅広く構える方がいいと思います。

予測サイズ 削除/引用 No.1524-6 - 2008/07/10 (木) 12:55:23 - めい 発現ベクターを作っているのですからCDSから分子量の予測はできますよね。 ペプチド部分の分子量はどれくらいですか？ それが50kDa程度であれば糖鎖の可能性は充分あると思います。

(無題) 削除/引用 No.1524-5 - 2008/07/10 (木) 07:40:38 - きりん みなさん御返信ありがとうございます。 PNGase Fなどに関しては全くの無知ですので、自分なりに勉強してから返信させていただきたいと思います。 ウエスタンで使用している抗体の説明書?を見る限りタンパクの分子量は80KDaくらいだと書いてあります。研究室のボスからはアミノ酸シークエンスをしようと言われました。おそらく業者にお願いする事になると思います。高いなぁと思いつつ…

(無題) 削除/引用 No.1524-4 - 2008/07/09 (水) 21:30:20 - A １アミノ酸の違いで起こるとは考えにくいのですが、SDS-PAGEから 予想される分子量と実際の分子量が大きく異なることがあります。 私はある転写因子でそのような例に出くわしたことがあります。 その確認も含めてマススペクトルを測定することは出来ませんか？ もし出来るのであればそのゲル上の蛋白質の正確な分子量を知る ことが出来ますしもし何らかの理由で短くなっているのであれば N末シークエンスの結果と予想されるアミノ酸配列の情報を含めて 現在の蛋白質が何番目のアミノ酸まで含まれているのか簡単に 知ることが出来ます。可能性としては １．SDS-PAGE上でたまたま小さく見えた。 ２．シュンさんがおっしゃるように糖鎖を含め何らかの修飾がある。 ３．翻訳後何らかの理由で部分的に分解された。 ４．何らかの理由で翻訳が上手く行っていない。 ぐらいでしょうか。４．はかなり可能性が少なそうですが１-３に ついてはマススペクトルの情報が得られれば何らかの判断が出来そうな 気がします。

(無題) 削除/引用 No.1524-3 - 2008/07/09 (水) 21:17:44 - 膜 面白いですね。N型糖鎖をPNGaseF等で除いた場合の分子量は比較されましたか？

糖鎖修飾の違いでは？ 削除/引用 No.1524-2 - 2008/07/09 (水) 21:06:51 - シュン シグナルペプチドが働かないためにERに入らず、分泌経路に乗らないために糖鎖付加が行われていないか、または、ちゃんとフォールディングされないためにERからでないためにコア糖鎖のみの付加だけの可能性は？ PNGase Fで処理してみて糖鎖を切ってみるとわかるかもしれません。 アミノ酸配列から推測される分子量はいくらですか？

シグナルペプチド変異症例 削除/引用 No.1524-1 - 2008/07/09 (水) 20:44:46 - きりん 膜タンパクのシグナルペプチド領域に一塩基置換のミスセンス変異を起こしている症例の検証をしています。 発現ベクターを構築。 ↓ 培養細胞に遺伝子導入し、回収。 ↓ ウエスタンブロット を行なったところ、WTでは80ｋDa程のバンドが現れた一方で、mutでは50kDaくらいのバンドが確認できました。 どういった理由で分子量が小さくなってしまっているのでしょうか？ ちなみに… ・シークエンス解析で配列を確認しましたが、問題はありませんでした。 ・他の実験系で必要であったのでC末端にtagをつけた発現ベクターも手元にあり、tagも発現していたのでstop codonがコードされたという可能性はないと思います。 同じような経験をされた方いらっしゃいませんか？

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