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ありがとうございます 削除/引用 No.1516-14 - 2008/07/10 (木) 01:51:41 - Hero 本日前回失敗した抗体を使用して再度tryしたWBがうまくworkしました。 皆さんの意見を参考に、一次抗体を遠心してその上清を使用したのと、二次抗体を5000倍に落としたくらいです。Washはむしろ短めで行いました。一次抗体はハイブリバッグでしたが、あまりtightにシールせずに、十分な液量を投与したので、実際には小さな箱でやるのとあまり変わりなかったかもしれません。自分的には二次抗体をむしろ薄くしたのにしっかりバンドが出ていたので、これが一番驚きであり、寄与しているような気がします。 もちろん、これで他の抗体もうまくいくとは限りませんが、今回のことを参考にしていきたいと思います。 しかし、そばで同じようにやっても全くきれいなWBをしている人もおり、中年さんが仰ったように単なるS/N比の問題、つまり抗体の性能の問題のような気もしますね。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1516-13 - 2008/07/10 (木) 00:05:36 - むら 使用している抗体が特別貴重なものでなければ、ハイブリバッグの代わりに、底が平らなプラスチック容器で抗体反応を行うことをお勧めします。容器代はたかが知れているので、新品または新品同様品で。もちろん、容器への抗体の吸着対策はしてください。

(無題) 削除/引用 No.1516-12 - 2008/07/09 (水) 19:05:58 - 中年 ハイブリバッグに入れるのは、少ない量の抗体溶液にメンブレンを浸すための優れた方法だと思いますが、それでもシールの時にバッグの材質が縮んだりして、抗体溶液が均一にメンブレンに触れているという状態を作り出すことは簡単ではありません。バッグが歪んでいるせいで、バッグ自体が直接にメンブレンに触れているような領域ができれば、その付近の抗体は早々に枯渇するでしょう。 以前のトピックでもありましたが、うちの研究室ではこれを避けるために、バッグにシールした後、それを２枚のガラス板に挟んでクリップで留め、バッグのでこぼこを均してしまった状態でインキュベートしています。バッグのビニール（？）の素材にはある程度の弾力があるので、平面性の高いガラス板に押し付けられることでシールした全体が均一な厚みになります。ギリギリの液量でも中でメンブレンが泳ぐことができるのが分かる程です。

(無題) 削除/引用 No.1516-11 - 2008/07/09 (水) 18:55:28 - isa 私も同じ問題で悩んでおります。 むらが出てしまいます。 ハイブリバッグでやったらいいというお話もあったので、それでやってみたのですが、うまくいったりいかなかったり。 ECLの現像の問題があるのでは？とも思います。一度現像した後に、膜をwashして再度ECLにつけて現像すると多少むらの模様がかわりました。しかし、どう解決したらよくなるかは、わかりません・・・・

(無題) 削除/引用 No.1516-10 - 2008/07/09 (水) 17:51:49 - 中年 【抗体の性能が良い場合はそういう現象が起こらずきれいにWBができる】のは、単なるＳＮ比の問題ではないですか？ シグナルが強ければ、バックグラウンドに多少まだら模様があっても、それが見えない程度の感光時間で十分バンドが見えるのに対し、シグナルが弱いと長時間の感光が必要になってバックグラウンドが問題になってくるということでは。

(無題) 削除/引用 No.1516-9 - 2008/07/09 (水) 16:57:11 - う〜んと ムラがでる一次抗体はいつも同じ種類なのですか？

(無題) 削除/引用 No.1516-8 - 2008/07/09 (水) 16:51:40 - K PVDFはタンパク質の保持力が高いので、バックグラウンドができやすい、というのを聞いたことがあります。 トピックの趣旨は、発色のときにムラができるということですが、 タンパク質が多く保持されているので、ランダムに結合してしまう一次抗体がある、 という可能性を考えてみました。 可能性としては無くはないと思います。 そこで、転写先をPVDF膜からNCMに変えてみるのはいかがでしょうか？ ウェスタンだけが目的ならさほどプロトコルを変えずに済むと思います。 もしかすると、プロッキングの時間を長く取ってみたり(４℃でO/Nなど)、 ブロッキング液の種類をPVPに変えると、上手く行くかもしれません。 劇的な変化は出ないかもしれませんが、ウオッシュに使うバッファーの塩濃度(~500 mM ぐらいまで)を上げるのも一つの手のように思います。

(無題) 削除/引用 No.1516-7 - 2008/07/09 (水) 15:47:38 - Hero いろいろとお返事をいただきありがとうございます。 まず、PVDF膜はすべての工程において乾燥しないように気をつけています。 抗体に関しては使用前に遠心はしていなかったのでしてみようと思いますが、一次抗体も二次抗体もほぼ新しいものであり、二次抗体に関してはほかの方が同じものを使用していますが、問題はないようです。実際、私がうまくいくときも同じ二次抗体です。 ECLの試薬を付けた後もラップやハイブリバッグといろいろ試しましたが、村のできないよう、泡や水滴の混入には気を付けております。 現像はフィルムで行っています。 以前に、失敗したフィルムを少し洗って再度ECLにつけて現像しても同じ結果でした。その時にはそのあとにstrip&reprobe(同じ抗体）をすると、やはりまだらができたのですが、一回目とは違うまだらだったので、やはり一次抗体あたりが怪しいと考えているのですが・・・。一次抗体も4種類くらいは普通にうまくいって、8種類くらいが全然うまくいかないといった感じです。 他のWBのスレで二次抗体の濃度が10000倍くらいでしないと白ぬけするような話があったと思うのですが、発現が強いバンドが白ぬけするというのではなく、バンドのあるところやbackground関係なくまだらになる感じなので。しかし、Thermo社のsupersignal west picoを使用しているのですが、これには二次抗体を20000〜100000倍にしろと書いてあるので、少し薄めてみようかと思っています。周りの人は2000倍くらいでうまくいってるみたいなんですけど、関係ありますかね。 それと、HRPをアジ化ナトリウムで除くと二次抗体からやり直せるという話でしたが、簡単なプロトコールみたいなものはありますでしょうか？ というか、そのまま発色させた後に再度二次抗体を入れるのはやはりだめなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1516-6 - 2008/07/09 (水) 14:05:51 - ~ どのようにして原因の切り分けができるかを考えてみました。 ECLで一度感光させてから、 もう一度ECL液に付け直して(別のハイブリバッグに挟んで)感光させて、 2枚のフィルムを比較した場合、ムラのパターンは同じなのですか？ 同じであれば、ECLより前に原因があるのでしょう。 二次抗体が原因であれば、感光後にメンブレン上のHRPをアジ化ナトリウムか何かで失活させてから、 もう一度、二次抗体で反応させれば、パターンが変わると思います。 これでパターンが同じであれば、一次抗体か乾燥が原因ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1516-5 - 2008/07/09 (水) 13:03:12 - ＤＮＡＩ 現像はインスタントカメラ、フィルムどちらでしょうか？ 私はPVDFをECL試薬に漬けた後、ハイブリパック（厚めのビニール袋）に入れて現像してます。検討段階初期ではむらが出ていることがありました。 改善のコツとしては １．ＥＣＬ試薬を現像時に持ち越さないようにする（試薬に漬けたPVDFの残存試薬をよく切ってからパックに入れる） ２．泡を抜く要領で試薬を均一化する ３.二次抗体濃度を10,000倍程度にする また、【抗体の性能が良い場合はそういう現象が起こらずきれいにWBができる】のは同じ二次抗体を使用していますか？そうならばHeroさんのおっしゃるとおり一次抗体の問題の可能性が高そうですが。

(無題) 削除/引用 No.1516-4 - 2008/07/09 (水) 09:14:57 - ~ ECLの試薬に付ける後のラップやビニール袋などではさむときに、 ムラができるとムラになります。 ムラが起きる場所をいろいろ聞いても自分の原因にたどり着けるかは分かりません。 ラボで誰か他の人が作って使い終わったメンブレンを貰って、抗体→検出だけやってみるとか、 逆に自分で作成したメンブレンを他の人に、抗体→検出してもらうなどで、 問題点を切り分けられませんか？

一例です 削除/引用 No.1516-3 - 2008/07/09 (水) 05:46:11 - PG 私もランダムに入るまだらになやまされた時期がありました。結局問題は2次抗体にありました。1次抗体はお手製なものでフリーザーに小分けして慎重に使っていたところが、2次抗体は小分けにせず4℃で長く保存していたのが原因でした。なんかチューブの中にモヤモヤができていました。遠心して取り除いても駄目で、買い換えたら美しいブロットに戻りました。特定の動物由来の抗体を使うときだけ発生する問題でしたらチェックする価値はあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1516-2 - 2008/07/09 (水) 04:24:34 - 名無し 抗体蛋白質が古くなったり凍結融解しすぎでダメになりかかってると変な感じに溶けている（不溶化一歩手前くらいかもう不溶化していますよ少しくらいの感じでひどいと沈殿してる時ある）ときがあってそういうのだと袋の中で液が静止している間にゆっくりとけて抗体の濃い所と薄い所ができてガンガン反応してるところとそうでない所ができてそうなるかもしれないそれでそういうときすればいいかというと抗体原液を卓上遠心して上澄み使うといいかもしれないつまり均一な濃度の抗体液をつくるのが大事でもこういう抗体はちかいうちにバックあがりまくったり全部の蛋白質と反応したりするようになって終わるのではやめにいい抗体かったほうがいい。 もうひとつはPVDF膜の取り扱いの所に問題があるのかなあともちょっとおもうそれはPVDFの前処理でメタノールに浸漬したり平衡化するときとかトランスファー終わってから膜を少し水で洗ってから（あるいは直接）ブロッキング液に入れるとときとか少し間あいてしまって部分的に乾いてしまってそれがあとあとまでひびいてるということはあるかもしれないということでなんでかというとリプロブで膜を再利用するときに中途半端にかわかすと（というかほんとは乾かすなら完全に乾かして乾かさないならずっと液の中に保ってやるんだけど）そんなふうになったのを今急に思い出した。

WBのまだら模様の原因 削除/引用 No.1516-1 - 2008/07/09 (水) 02:31:48 - Hero 毎日WBばかりやっている（失敗するから）へたくそ研究者です。 今まで色々な失敗を乗り越えてきたのですが、今長い間原因が同定できない失敗に悩まされていまして、皆さんのお力を借りれたらと思いメールしました。 それは、WBで現像したときに、まだら模様になる現象です。 言葉では分かりにくいのですが、いわゆるTransferのときにairが入るような抜けではなく（実際、マーカー蛋白は常にきれいにtransferされています）、現像した写真自体が薄いところと濃いところがまだらにランダムに存在している感じなのです。このため、見たいたんぱくの量に差があるのか、このまだらのせいなのかわからないのです。また、このまだらはレーンや分子量のどれとも関係なく、不均一に一部が薄いといった感じです。 まず思いつくのは一次抗体を投与しているときのムラかと考えました。当初、ハイブリッパックを切ったものにミニゲルサイズのPVDF膜（8x5cm程度）を入れて、そこに6〜8mlのTBST+抗体を入れていたのですが、そこを15ml程度とかなり大量に入れてもやはり変わらず。（ちなみに一次抗体は常に４℃O/Nです）。Washの問題かと思い、絶対に膜が表面に出ないように、大量にTBS-Tを入れて、時間も短い場合５分x３回、長い場合は時間単位で洗ったりしてみましたが変わらず。二次抗体も2000倍〜4000倍と変えても変わらず。 現像の時もラップやハイブリパックを使ってみたが変わらずお手上げになっています。 しかし、抗体の性能が良い場合はそういう現象が起こらずきれいにWBができるので、やっている抗体でlethalな間違いは犯していないと思い、抗体のせいにしているのですが、抗体のせいでそんなまだらが起きるのでしょうか？ ちなみに、他の条件としては泳動は200Vで約1〜1.5時間、Transferはwetで100V、4℃で1時間、ブロッキングは5%skinmilkで常温1時間（これは2.5%BSAでやったこともありますが変わりませんでした）、washは1次抗体の後に3回、2次抗体の後に4回です。発色はECLです。 普段よく記載されているこういった条件以外のちょっとした主義的なことも含めて、何か経験がおありの方や、解決策をご存知の方がおられましたら、力を貸してください。 すでにこれで数十回失敗しています。 よろしくお願いします。

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