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蛇足ですが 削除/引用 No.1515-17 - 2008/08/01 (金) 08:46:15 - あああ このトピックで、簡単なジェノタイピング用の尻尾の処理法を知り、ラットの尻尾でも試してみましたら、3-5ミリほどの尻尾だと、95度30分では、殆どバラバラにならないのですが（見た目、毛が取れたのと、表面の皮が若干溶けた感じ）、それでも、十分にジェノタイピングに使用できました。

ありがとうございました。 削除/引用 No.1515-16 - 2008/07/31 (木) 23:02:52 - ＪＫ さっそく試してみます。 ありがとうございました。

しっぽ 削除/引用 No.1515-15 - 2008/07/30 (水) 00:11:15 - tail+prep 書き忘れてました。しっぽを細かく刻む必要は無いと思います。私はやったことがありません。95C, 30minutesのステップでかなりバラバラになりますし。

しっぽ 削除/引用 No.1515-14 - 2008/07/30 (水) 00:09:36 - tail prep 私は2-3mm位の長さでカットしていましたが、同僚のアメリカ人は5mm以上の長さを使っていました。どちらにしろ、うまくPCRはかかっていました。参考になれば幸いです。

しっぽについて 削除/引用 No.1515-13 - 2008/07/29 (火) 21:38:25 - JK こんにちは。 ひとつ質問をさせてください。 tail prepさんの方法でPCR用のサンプルを調製しようと思っているのですが、 しっぽは何ｍｍぐらい使っていますか？ また、しっぽは細かく切った方がよいのでしょうか？ よろしくおねがいします。

(無題) 削除/引用 No.1515-11 - 2008/07/12 (土) 00:36:16 - mi うちでは耳パンチのとき出る耳片を使ってgenotypingしてます。 プロトコールはKickさんのとほぼ同じですが、PCR tubeに耳片を入れ、 Lysis bufferを50-100ulほど加え、PCRマシンで55℃ 3hr）、85℃ 20min 反応させ、遠心して上清1ulをテンプレートにしてPCRしています。 500bpくらいまでは大抵問題なくPCRがかかります。 この方法の利点は、PCRマシンにかけてほっとけばいいこと、 弱点はNaOH法よりちょっと時間がかかることですが、55℃インキュベート中にちょっとPCRマシンのふたを開けて、サンプルをMixしてやれば、多少時間短縮 できます。 Lysis bufferの組成は、 50mM KCl 1.5mM MgCl2 10mM Tris-HCl pH8.5 (at 25℃) 0.5% Tween20 に、使用直前にProKをfinal 1mg/mlになるよう混ぜて使います。

(無題) 削除/引用 No.1515-10 - 2008/07/11 (金) 00:53:04 - ami ちなみに、 > Transfer supernatant to new tube は省略しました。

(無題) 削除/引用 No.1515-9 - 2008/07/11 (金) 00:41:19 - ami > DirectPCR Lysis Reagent > 本当らくちんです。 コピーですけど、 Add 600ul 50mM NaOH to tail Heat at 95C, 30 minutes Vortex Neutralize with 50ul 1M Tris (pH 8 Centrifuge 5minutes Transfer supernatant to new tube Use 1-3ul for PCR のほうが簡単げですけどどうでしょうか。

DirectPCR Lysis Reagent 削除/引用 No.1515-8 - 2008/07/11 (金) 00:33:16 - Kick DirectPCR Lysis Reagent, Viagen Biotech これおすすめです。 proteinaseK とこれを混ぜて、55度 5時間、85度 45分でサンプルの出来上がりです。 これを直接1ultemplateとしてPCRで来ます。 本当らくちんです。

(無題) 削除/引用 No.1515-7 - 2008/07/10 (木) 23:15:30 - ami tail prepさんのプロトコールでTypingできてました。 ありがとうございました。だいぶ簡単になりました。

(無題) 削除/引用 No.1515-6 - 2008/07/10 (木) 00:26:54 - ami 今日tail prepさんのプロトコールでやってみました。ＰＣＲまでできました。明日電気泳動して結果を報告します。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1515-5 - 2008/07/09 (水) 16:41:02 - mi うちも、tail prepさんとほぼ同様の方法でやってます。 参考文献： Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 2000 Jul;29(1):52, 54. これを知ってから、もうProK&フェノクロには戻れません。

(無題) 削除/引用 No.1515-4 - 2008/07/09 (水) 09:37:50 - ぱおーん うちでは7mmくらいのしっぽにを５片くらいに刻んで、200 ul tubeに移し、50 ulのDWを加えて95℃, 10 min。その後、よく冷ましてから10 mM PROK 15 ulを加えて、55℃, 3 h。あとは95℃, 10 minでboilしてPROKの失活。上清1 ulをPCR。

(無題) 削除/引用 No.1515-3 - 2008/07/09 (水) 09:09:20 - おお フェノクロなしでいきなりエタチンでしてました。 でもPKで消化する時間は短くできませんね。 尻尾の代わりに耳を使えば早くなるかもしれません。

tail prep 削除/引用 No.1515-2 - 2008/07/09 (水) 08:02:06 - tail prep 以前いたラボで教えてもらったプロトコールです。PKでovernight、フェノクロ沈といった面倒なステップが無いのでかなり楽だと思います。 Add 600ul 50mM NaOH to tail Heat at 95C, 30 minutes Vortex Neutralize with 50ul 1M Tris (pH 8 Centrifuge 5minutes Transfer supernatant to new tube Use 1-3ul for PCR

ＫＯマウスタイピング前の処理 削除/引用 No.1515-1 - 2008/07/09 (水) 01:56:23 - ami お世話になります。 ＫＯマウスのしっぽからＤＮＡを抽出してタイピングを行うときに、どういう手順でやってますか。簡単な手順があれば知りたいです。 今は、しっぽをProtainase Kで一晩溶かして、フェノール・クロロホルム処置して、エタノール沈殿して･･･とレトロな(？)方法でやってます。時間かかります。

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