Ｎｏｖａｇｅｎのバキュロウイルス トランスフェクションキットを用いているのですが、うまくトランスフェクションされません。
身近に扱ったことがある人がいないので、独学で行っていまして、まだコントロールプラスミドを用いての練習なのですが、
操作方法に自信がない点だらけでして、以下の事について教えていただけますでしょうか。
@Direct Plaquing Transfectionの方で行っているのですが、dishに付着させた昆虫細胞に、Insect Gene JuiceとプラスミドDNA&バキュロウイルスとの混合液を加える際、dishの培地は完全に除去してから行うのでしょうか？のせる量が0.1mLですと、60mm dish全体に行き渡るのかなーと。培地を少しだけ残しておくのでしょうか？
AプラークをX-gluで染色したいのですが、X-glu solutionを加え、一晩置いておいた所、かなり濃い希釈のものだけに、dishの中央辺りに塊っぽく青く染色したものがあったのですが、これはプラークではないのでしょうか？細胞が付着してなくて剥れてきてる？部分もあったのですが・・。また、X-Glu solutionの溶媒は培地ではなく、ＰＢＳで行うのでしょうか？一昔前のあるプロトコールでは培地でしたので、培地を使っていたのですが、今のはPBSが普通なのでしょうか？
B基本的なことですが、プラークは単層にどのくらいの大きさでできるのでしょうか？正しいプラークを見たことがないので、どういうふうに見えるのかと・・。顕微鏡ではなく、シングルプラーク数を肉眼でカウントするということは、それなりに大きくみえてくるのでしょうか？通常の細胞は、顕微鏡が必要かと思うのですが。。
以前にも経験者がいないのに、無謀と言われていましたが、やらざるを得ない状況でして、何かアドバイスしていただけると嬉しいです。
宜しくお願い致します。 |
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