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(無題) 削除/引用 No.151-6 - 2007/09/07 (金) 09:32:28 - Ｔ Freundlieb, S, Schirra-Mu¨ller, C, Bujard, H, A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells., J Gene Med, 1, 1, 1999 の Fig. 1 にあるように、Tet-responsive vector 単独のトランスフェクションである程度レポーターが活性化されます。その程度は細胞株によって異なり、HeLa では低く、CHO, HEK. COS では高いようです。 樹立したクローンと親細胞株とで差がないなら、おそらく TetOff (tTA) がうまく発現していないものと思われます。 CHY さんが書かれているように、pTetOff とレポーター両方を transient で発現したものと比較すればはっきりするでしょう。

(無題) 削除/引用 No.151-5 - 2007/09/07 (金) 01:05:43 - CHY もしかすると、私が質問の内容を誤解しているのかもしれないのですが... >pTet-offベクター無しの親細胞で既に高い発現を示している >（バックグラウンドとして無視できないくらい） これは、他の細胞を使ったときには見られないくらい高いということなのでしょうか。あるいは既にTet-offがstableに入った他のcell lineにpTRE2-Lucを入れたときと同様の強い発現が見られたという事なのでしょうか？ Clonthechのinstruction(PT3001-1, page23)にもあると思いますが、tet-systemでは発現を完全に0にする事はむずかしく、発現量を何倍(Dox濃度によりますが1/1000とかのオーダーです)に抑えるか（上げるか）という感じだと思います。Western Blotでの検出限界以下にまで抑える事はできますが、Luciferase assayは感度の高い検出方法ですので、inactive(+Dox)の状態でもシグナルが検出されるのだと思います。 もっとも、pTRE2-側だけをtransfectして検討したことはないので、お使いになっている親細胞が原因という可能性も残されると思います。 もし周りに樹立されたTet-off細胞があれば、それにpTRE2-Lucをtransfectして、DoxでどのくらいLucの発現をコントロールできるものなのか体験されてみてはいかがでしょう。 いずれにしても、使っているシステムがラボの環境で働くものなのか、なんらかのpositive controlが必要のように感じます。もし樹立されたTet-off細胞をお持ちでなければ、親細胞やCOS7, HEK293などを使って、pTet-offとpTRE2-Lucをtransientにco-transfectし、+Doxと-Doxできちんと差が出るかを見てみてはいかがでしょう。 >ご指摘の中の「Tet-offシステムに向いていない細胞を使っている」ということですが、そのよう>な細胞はやはりあるものなのでしょうか？ cell lineによってinduction/inhibitionの程度が異なるので、Tet-offに向かない細胞があるのかもしれないと考えただけで、具体的にそのような例を知っている訳ではないものですから...混乱させてしまったようで申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.151-4 - 2007/09/07 (金) 00:36:18 - 素人 間違ってたらすいません。pTRE2はCMVプロモーターをもっているので調節因子がなければ発現するのではないでしょうか？発現量については差がでるような気もしますが・・・。 比較するべきは調節ベクターを導入しクローン化した細胞中で、Dox存在、非存在下でのルシフェラーゼ活性なのでは？

(無題) 削除/引用 No.151-3 - 2007/09/06 (木) 15:28:57 - まねきねこ 御助言ありがとうございます。 （１）についてですが、私が今戸惑っているのはpTet-offベクターの制御下で発現するであろうpTRE2-Lucが、pTet-offベクター無しの親細胞で既に高い発現を示している（バックグラウンドとして無視できないくらい）ということです。私の実験操作上のアーティファクトであるかということなので、（１）は関係ないと思うのですが、どうなのでしょう？ （２）についてですが、親細胞で無視できないくらいの発現がある今の時点ではご指摘の実験は意味を成さないと思いやっておりません。ご指摘の中の「Tet-offシステムに向いていない細胞を使っている」ということですが、そのような細胞はやはりあるものなのでしょうか？ また、もし向いていない細胞でないのであれば、他に原因があるのかと悩み中です。使っているDNAは買ったばかりのもので、それから直接（増やしたりせず）使ってチェックもしているので、もしちがうとメーカーの間違いということになるので・・・。

(無題) 削除/引用 No.151-2 - 2007/09/05 (水) 14:26:15 - CHY (1) Tet-system 用にtetracycline-freeと確認されたFBSを使っているでしょうか？ モノによるのですが、飼育中に与えられたtetracycline様の物質が血清中に残留していて、Doxによるinduction/inhibitionの程度が小さくなることがあります。 お使いになっているのがTet-offシステムなので、FBS中に残留しているtetracycline様の物質で既に発現が抑えられてしまっているという事はないでしょうか。 (2) pTet-off とpTRE2-Lucをtransientにco-transfectして、Doxで発現をコントロールできるかチェックしてみてはいかがでしょう。 この時点で+Doxと-Doxの間にあまり差がなければ、使っているコンポーネントが間違っているか、Tet-offシステムに向いていない細胞を使っている等の問題があるのではないかと思います。 また、stable cell lineを作るときのtransgene発現の安定性（？）については、他のトピックでもよく説明されていたように思います。

Tet off細胞株樹立について 削除/引用 No.151-1 - 2007/09/04 (火) 17:21:02 - まねきねこ Tet off細胞株を自分で樹立しようと思い、Tet off調節vectorをtransfectionして薬剤でselectionして数クローンを得ました。 どのクローンが使えるか、キットに付属のpTRE2-Lucコントロールベクターを単離してきた細胞にtransfectionし、Tetによる調節やルシフェラーゼ活性が高いクローンを選別しようと試みました。 しかし、Tet off調節vectorを導入していない親細胞においてルシフェラーゼ活性が検出されます（導入した細胞と差が無いくらい）。 こういうことってあるのでしょうか？ transfectionのときのpTRE2-Lucコントロールベクターの量が多すぎるためかと思ったのですが、そういうことってあるのでしょうか？ Tet offについて、全くの素人なので教えていただければ幸いです。 ちなみに、pTRE2-Lucコントロールベクターをtransfectionした方法ですが、 12well dishに２×１０の５乗の細胞をまく 次の日、リポフェクタミン2000を４マイクロリットルとDNAを1.6マイクログラム でtransfection 48時間後、ルシフェラーゼアッセイ です。

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