BioTechnicalフォーラム [哺乳類細胞用低発現ベクター]

哺乳類細胞用低発現ベクター

No.1508-TOPIC - 2008/07/08 (火) 01:55:40 - DSC

哺乳類の培養細胞にトランスフェクションして、目的遺伝子をあまり高レベルでなく発現させることのできるプラスミドベクターをご存じでしたらお教え下さい。

ある遺伝子の転写産物（mRNA前駆体）の細胞内でのプロセシングを見ようとしているのですが、手持ちのCMVプロモーター付きのベクターを用いてその遺伝子を発現させたところ、細胞内のプロセシング活性に対するその転写産物の量が多かったのか、プロセシングの様子がまったく観察されませんでした。

そこで発現量を低く抑えて同様の実験を行いたいと考えています。見たいものがRNAなので、発現量が少なくてもプロセシングのプロファイルはRT-PCRにより調べることが可能です。細胞はHEK293を用いており、当該遺伝子が内在的には発現していないことは確認しています。

Tet-on/offのような発現調節系ではなく、常に低発現するようなベクターを探しています。ご存じの方がおられたら、よろしくお願い致します。
　

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No.1508-12 - 2008/07/10 (木) 13:14:57 - プロモ

それよりも、発現時間をずっと短くしてみるというのではだめなんでしょうか？あるいは安定発現細胞を作った方が良いような気もしますが。

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No.1508-11 - 2008/07/10 (木) 09:21:01 - おお

RNAのプロセッシングという事なので、プローモーター依存性ということも考えられますね。詳しいことは書かれていませんのでよく分かりませんが、その遺伝子のプロモーター領域を取ってきて、その上流にエンハンサーをかまして発現を促すのもてかなとも思っています。でも、プロモーターが強いせいなのかどうか見分けるのは難しいですと思いますが、、、、、

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No.1508-10 - 2008/07/09 (水) 21:55:05 - DSC

> うーんとさま

もともと脳での発現がわかっている遺伝子で、脳のRNAからRT-PCRによりそのcDNAを増幅可能なプライマー対をもっています。293のRNAに対してそのプライマー対でRT-PCRを行っても増幅産物が得られませんでしたので、293では発現していないものとして扱っています（ちなみに、CHOのRNAでは同様の方法で発現を確認しました。ヒト-ラットでオリゴ部分の配列はほとんど同じです）。

> 中年さま

早速読んでみます。情報を頂き、ありがとうございました。

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No.1508-7 - 2008/07/09 (水) 17:46:56 - 中年

古い論文ですが、次の２編が参考になるかもしれません。

Anal Biochem. 1994 Sep;221(2):416-8.
A comparison of different promoter, enhancer, and cell type combinations in transient transfections.
Wenger RH, Moreau H, Nielsen PJ.

Anal Biochem. 1997 Mar 1;246(1):150-2.
A systematic comparison of relative promoter/enhancer activities in mammalian cell lines.
Liu Z, Cashion LM, Twu JJ.

(無題)

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No.1508-6 - 2008/07/09 (水) 16:07:07 - DSC

みなさま、ご回答ありがとうございます。
教えて頂いた中では、PGKとTKを現在所有していますので、試してみようと思います。
細胞種や条件により何とも言いがたいかもしれませんが、これら2つのプロモーターの強弱について、何か情報をお持ちの方がおられたらお教えください。
よろしくお願い致します。

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No.1508-5 - 2008/07/08 (火) 15:35:49 - 1

sv40

(無題)

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No.1508-4 - 2008/07/08 (火) 10:27:12 - うーんと

>細胞はHEK293を用いており、当該遺伝子が内在的には発現していないことは確認しています。

どのように確認したのですか？