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(無題) 削除/引用 No.1505-9 - 2008/07/07 (月) 23:32:41 - ポカピン964ml APさん たしかに、目的バンドの倍のサイズ位だったので二量体ぽいかな？とも思いましたが、そうなる理由が思いつきませんでした。勉強になりました。テンプレート、酵素の量は再度検討します。最初からEx Taq使えばよかった（涙笑） おおさん サンプルの違いとして、�@と�Aは違う個体のラットから肝臓をもらいました。抽出その他に特に違いはありません（断言できませんが）。なお、抽出にはRNeasy Mini Kitを使ってます。 Caspaseさん RT酵素なしのネガコンをとり、PCR時に用いています。Ex Taqを使ってサンプル�@のネガコンからバンドが見えるということはありませんでした。最高40サイクルまわしてみましたが。 皆さんご指摘ありがとうございます。プライマー自体は文献を参考にしています。primer3で設計してみようとしましたが、いまだ勉強中なもので、悪戦苦闘しています。超ど級初心者が実験していますので、皆様からの叱咤激励はありがたい限りです。

(無題) 削除/引用 No.1505-8 - 2008/07/07 (月) 23:00:45 - AP >Caspaseさん >RT-productへのゲノムDNAの混入は考えられませんか？ RT-PCRだと可能性ありますね。 RTなしでPCRしたコントロールはとっていますか（これは必須のコントロール）？ 競合するcDNAがなければ、微量であってもコンタミしているgenomic DNAが確実に増幅するはずですので、容易に判定がつきますね。 シークエンスが無理でも、制限酵素の切断パターンでゲノム由来かどうかわかるかも。

(無題) 削除/引用 No.1505-7 - 2008/07/07 (月) 22:43:54 - Caspase RT-productへのゲノムDNAの混入は考えられませんか？ 用いたプライマーでgenomeをテンプレートとした場合に600bp位の産物が得られるかどうか確認はされましたでしょうか。 これまでの経験からExTaqは極めて増幅効率が良いように思いますので、普段の酵素ではPCRが掛からないくらいの微量なgenomeが混入していて、ExTaqではこれが増幅されたということはないでしょうか。 genomeの混入であればRT-reactionの前にRNAに対してDNase処理を行うと良いでしょう。 勿論他の原因も考えられますが、私なら最初にこれを疑います。

(無題) 削除/引用 No.1505-6 - 2008/07/07 (月) 22:27:50 - おお あ、サンプルの違いとしては、何か心当りはありますか?

(無題) 削除/引用 No.1505-5 - 2008/07/07 (月) 22:24:53 - おお >[Re:3] ポカピン964mlさんは書きました : > もちろんシークエンスを読めればいいのですが，利用登録やら利用料やら諸々の場面でお金がかかるため，現状では無理と思っています．あと，サンプルはラット肝臓です． シーケンスは必須だとおもいます。Ensembl などで、アイソフォームとか見つかりませんか? ちょっとした酵素などの特性の違いで、今まで見えてなかったものが見えたという感触はありますが、600のものが、ノンスペで見る必要のないものであればじゃまをしない限り、無視する手もあると思います。 酵素など変えて、それまでの実験と比較できますか? 毎回コントロールをとれば大丈夫かもしれませんが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1505-4 - 2008/07/07 (月) 22:18:40 - AP >昨日，RTサンプル(とりあえず�@)をPCRにかけたところ，目的の280bp以外に600bpにもバンドが見られました． PCRは感度が高い反面、非常にartifactが出やすい方法でもあります。 これも良くありがちな現象の一つで、驚くべきことではないように思います。 PCR産物が重合して二量体（という表現が正しいかわかりませんが、要はPCR産物が2分子つながった状態）になっている考えられる可能性が考えられます。 PCR産物の末端が、同じPCR産物の別の部分と（多少のミスマッチがあっても）アニールすると複数分子のPCR産物がキメラになったものができて、それが増えてくることによって生じます。 目的の断片はどのくらい増えていますか？　飽和して、これ以上増えないくらいたっぷり増えているなら、サイクルをまわしすぎ、鋳型の入れすぎ、あるいは酵素過剰かもしれません。 飽和するくらい増えていると、ちょっとした加減でこのようなartifactが出たり（運が良いと出なかったり）することはあると思います。

(無題) 削除/引用 No.1505-3 - 2008/07/07 (月) 21:59:04 - ポカピン964ml おおさん レスありがとうございます． もちろんシークエンスを読めればいいのですが，利用登録やら利用料やら諸々の場面でお金がかかるため，現状では無理と思っています．あと，サンプルはラット肝臓です．

(無題) 削除/引用 No.1505-2 - 2008/07/07 (月) 21:17:39 - おお >[Re:1] ポカピン964mlさんは書きました : > この600bpのバンドの正体をどうやって確かめようかと考えてます． 切り出して配列を調べてみればいいと思います。 使っている生物は何でしょうか?

サンプルの違い？酵素の違い？ 削除/引用 No.1505-1 - 2008/07/07 (月) 20:49:17 - ポカピン964ml RT-PCRをやり始めて1ヶ月程度の初心者です． 昨日，RTサンプル(とりあえず�@)をPCRにかけたところ，目的の280bp以外に600bpにもバンドが見られました． 「何かコンタミした?」と思いましたが，これまで（といっても初心者ですが．．）目的以外のバンドが出るといったことはありませんでした． また，これまでPCR時には日本ジーンのGene Taq NT(とりあえずA)を使っていましたが，この600bpのバンドが出た時はタカラのEx Taq(とりあえずB)を使いました．もしや酵素の違いかと思い，両酵素および前述のRTサンプル(�@)に加え，2週間前のRTサンプル(とりあえず�A)を使いPCRしてみたところ，�@-Bの組み合わせのみで600bpのバンドが見えました．あ，ちなみに30サイクル回してます． サンプルの違いで600bpのバンドが出たのか，酵素の違いで出たのか分からず，この600bpのバンドの正体をどうやって確かめようかと考えてます．もちろんRNAの抽出やRTなども考えないといけないですが．．． 長文，乱文で恐縮ですが，皆様のお知恵をお貸し下さい．よろしくお願いします．

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