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(無題) 削除/引用 No.1504-17 - 2008/07/09 (水) 07:29:49 - Y 補足です。 ２次抗体は説明書通りの１０００倍希釈ということで特に問題ないと思います（節約のため２０００倍希釈でもよい）。 タンパク質20ugアプライとのことですが、whole cell lysateと仮定しても、b-actinのようなアバンダントなタンパクには乗せすぎだと思います。おそらく 1ugで十分と思います。GFAPについては分かりません。すいません。 基本的に２次抗体は、メンブレン上でタンパクに結合した１次抗体に対し過剰量あるべきものだと思うので、おそらく２次抗体の希釈率を変えることにより白抜きの問題は解決するでしょうが、本質的解決法ではないと思います。 レスが手遅れのようですが、今見ましたものでご了承下さい。

(無題) 削除/引用 No.1504-16 - 2008/07/09 (水) 05:53:01 - Y 私ならタンパクアプライ量を1/10以下にします。２次抗体濃度はそれほどいじりません。 （タンパクアプライ量そのままで２次抗体濃度を下げても、おそらく分厚いバンドが出るだけでしょう。）

発光基質について 削除/引用 No.1504-15 - 2008/07/08 (火) 17:08:47 - グリアル Ａさん＞私も同じ発光基質つかってます。 　　　　早速、今日Western blotの1日目実施しました。 　　　　明日、二次抗体薄めて実施してみます。

(無題) 削除/引用 No.1504-14 - 2008/07/08 (火) 15:49:28 - A > 皆さんは検出は発光基質なのでしょうか？ 私の研究室ではこの発光基質を使っています。 http://www.piercenet.com/Products/Browse.cfm?fldID=01041101

(無題) 削除/引用 No.1504-13 - 2008/07/08 (火) 14:30:44 - K 横から失礼します 皆さんの希釈倍率がとても高くて驚いております。 皆さんは検出は発光基質なのでしょうか？ それならば、納得がいくのですが。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1504-12 - 2008/07/07 (月) 23:47:12 - グリアル APさん >>　最近の情報、確認しました。ありがとうございます。 Aさん >> 今までa-actin(sigma)を利用していたのですが、二次抗体×1000で非特異的なバンドは出てましたが、明らかな特異的バンド（42kDa）がありましたので、問題なく実施しておりました。 しかし、b-actin（Sigma）に変えると、抜け落ちる現象がありました。 １．抗体の性質 ２．キャリアの濃度（BSAなりスキムミルク） ３．洗浄のやり方（バッファー量、時間、回数など） やはり二次抗体が濃すぎるのですね。 私は説明書の推奨値から始めますので、だいたい一次抗体×200〜5000です。 4℃ Overnightは必ず実施しております。 二次抗体はいつも×1000でした。あまり気にせず、実施できてましたのでバックが高い時はwashの時間を延ばして、現像時間の短縮などにより克服できてました。 ただし、二次抗体はいつも室温１時間反応でした。 さっそく、室温で2時間反応かつ×10000（10mLでメンブレンを浸しているので1uLですか、、）くらいで実施してみたく思います。

(無題) 削除/引用 No.1504-11 - 2008/07/07 (月) 23:34:05 - A > １．一次抗体が薄く、二次抗体が濃すぎる時 > ２．一次抗体が濃く、二次抗体が薄すぎる時 正直なところシグナルが弱かったりバックが高かったりするのは １．抗体の性質 ２．キャリアの濃度（BSAなりスキムミルク） ３．洗浄のやり方（バッファー量、時間、回数など） によって大きく左右されるでしょうから得られた結果から どちらの抗体濃度問題があるのかなどは判断できないでしょう。 私の場合とりあえず 　1次抗体：3､000倍希釈　４度でオーバーナイト反応 　2次抗体：15,000倍希釈　室温で２時間反応 当たりで様子を見てバックが高かったりシグナルが弱かったり するようならそれぞれの抗体の濃度を個別に振って状況を見る といった感じで条件検討を行っています。１次抗体の４度 オーバーナイトの条件だけは固定しています。これはこの条件を 室温２時間に変えてかなりの時間を使って準備したサンプルが 検出できなくなって泣いたことがあるからです。２次抗体に ついては反応が弱い時には同じように４度オーバーナイトで 反応させたりしてます。

(無題) 削除/引用 No.1504-10 - 2008/07/07 (月) 23:09:22 - AP >ぜひ、これまでの質疑を見たいのですが、検索語教えて頂けないでしょうか。 直近だとこれかな http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=7;Code=1306 古いフォーラムからは http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1447

どうもありがとうございます。 削除/引用 No.1504-9 - 2008/07/07 (月) 22:13:17 - グリアル う〜んとさん、Aさん 一次抗体は説明書通りですが、Lysateの濃度に寄り切りですね。 二次抗体、何も考えず説明書通り×1000で実施してました。 Recombinantも抗体が認識していての明らかな白抜けですので、（１バンドの両サイドは出てますが、真ん中だけ白かったりします）二次抗体、×5000くらいから実施したいと思います。 素人質問で申し訳ございませんが、下記の場合だとどのような状態になるのか、教えて頂けませんか。 １．一次抗体が薄く、二次抗体が濃すぎる時 ２．一次抗体が濃く、二次抗体が薄すぎる時 たとえば、Ｘ線用フィルムでバックが真っ暗になりすぎる等。 今回のような白抜けは、一次抗体は濃く、二次抗体も濃いということですね。

(無題) 削除/引用 No.1504-8 - 2008/07/07 (月) 21:23:51 - A 私の研究室ではものにもよりますが 　　1次抗体：3000-5000倍希釈 　　2次抗体：10000-50000倍希釈 でやっています。WBで2次抗体の希釈はこれ以上濃くすることは 経験上ありません。シグナルが出ない場合たいてい1次抗体の認識に 問題があることのほうが多く1次抗体を500-1000倍希釈で使う ことはあります。話からするとうーんとさんがおっしゃるように 2次抗体が濃すぎるようですね。

(無題) 削除/引用 No.1504-7 - 2008/07/07 (月) 21:07:40 - うーんと そうです。 たぶん二次抗体が濃すぎるのだと思われます。 2000倍ででもできるのではないでしょうか。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1504-6 - 2008/07/07 (月) 20:46:41 - グリアル APさん＞Western,希釈率,白ぬけ,剥がれるなどで検索したのですが、 　　　　見当たらなく、質問しました。 　　　　ぜひ、これまでの質疑を見たいのですが、検索語教えて頂けない 　　　　でしょうか。 A、うーんとさん 　＞二次抗体は通常×1000で利用してます。 　　一次抗体は説明書通りに実施し、蛋白量は概ね20ug程度です。 　　b-actin,GFAP以外は殆どうまくいっております。 　　 　　うーんとさんの最初の文ですが、”二次抗体が濃い”からで宜しい 　　でしょうか。 　　そうなりますと、対処法としては、 　　・二次抗体を×1000よりも薄める 　　・蛋白量を減らす 　　 　　ということですね。

(無題) 削除/引用 No.1504-5 - 2008/07/07 (月) 20:07:49 - うーんと 二次抗体の希釈倍率が低いからでしょう。 濃すぎるので目的のbandのところだけ早く基質が消費されてしまい、抜け落ちてしまうことは多々有ります。特にwestern初心者の場合。 なので、二次抗体をもう少し薄めてtryしてみてください。 過去のトピックでも同じような内容がありますよ。 ご確認ください。

(無題) 削除/引用 No.1504-4 - 2008/07/07 (月) 20:07:48 - A 蛋白質の量が多すぎるのかどうかについては膜に転写した後に PonceauSで染めてみればわかります。精製蛋白質なのか破砕した 細胞の上清なのかわかりませんがどれぐらい転写されているのか わかると思います。もしその辺りの当たりが付けにくいのであれば 他のレーンに量のわかっているBSAなりをのせてみれば判断できると 思います。 また目的バンド付近だけ抜けているということですがおそらくその部分 に反応している２次抗体が多すぎてシグナルをX線フィルムなりで検出する 前にその付近の基質が全て分解されてしまったため白くぬけているのでは ないかと思います。もしそうであれば蛋白質をのせ過ぎです。蛋白量を 少なくとも1/10以下にすると共に抗体（1次もしくは2次どちらがいいのか わかりませんが）ももっと減らしてもいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.1504-3 - 2008/07/07 (月) 20:05:53 - AP >ところが、両方とも目的のバンド付近だけ剥がれているようです。 「バンドが剥がれている」というのはあなたの予想、判断の類だと思いますが、 まず、私見を入れない、実験結果の記載、描写をすべきでしょう。 論文書くときと一緒で、一次情報である結果の記載は客観的事実に徹し、二次情報である判断、考察とは明確に区別することを意識しなければなりませんね。 で、事実としてどういう事が起こったのでしょうか？ peroxidase標識をルミノールで検出してバンドが白抜けしたという現象でしたら、過去になんどがトピに上がっていますが。

(無題) 削除/引用 No.1504-2 - 2008/07/07 (月) 20:04:03 - 逆質問 剥がれているとは？

Westernでの抗体希釈率に関して 削除/引用 No.1504-1 - 2008/07/07 (月) 19:53:09 - グリアル Westernでシグマ社のb-actn, GFAP(rabbit)を染めたいと思い、通常通りのWesternのやり方で、希釈率をそれぞれ下記の手順で測定しました。 b-actin ×5000, 10000 GFAP ×200, 1000 ところが、両方とも目的のバンド付近だけ剥がれているようです。 これは、抗体が濃すぎて剥がれているのか、あるいは足りなくてついていないのか、どちらなのでしょうか。 次にTryする手順としては、泳動させる量を単純に少なくしてやってみるのが一番でしょうか？

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