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ご指導ありがとうございます。 削除/引用 No.1499-6 - 2008/07/08 (火) 02:03:43 - ミトコン 細胞破砕の際に顕微鏡でチェックは行ってみようと思います。ただ、50 strokesより少なくすると核画分へのミトコンドリアの漏れ出しが多くなったような気がしたので、未破砕細胞が最後のsample bufferで溶解しミトコンドリアタンパクが漏れ出したのではと思っていました。そのようなことはあまりないのでしょうか。 また、皆さんはwestern blotを行う際にタンパクが同じ量流れているかをどのように調べていますか。普段はactinなどで補正するのですが、分画しているのでこの方法以外で良い方法があれば教えていただきたいです。お願いします。

(無題) 削除/引用 No.1499-5 - 2008/07/07 (月) 21:56:26 - おお >[Re:4] 細胞屋さんさんは書きました : > > 『Potter型ホモジナイザーで』ーーpotter強すぎ。培養細胞の場合は普通はダンス型を使って手動で丁寧にやる。 > > 『50strokes後』ーー50回多過ぎ。細胞によるけど大抵10回かもう少しくらいガラスを強めにすりつけるようにしてゆっくり上下すればいいと思う。ちゃんとこわれてるか心配なら顕微鏡でチェック。 > > 培養細胞をPotter型ホモジナイザーで50回もやったら核もミトコンドリアも大変なことになってるような気がします。 わたしも強すぎてないかなと感じています。

potter強すぎ、50回多すぎ。 削除/引用 No.1499-4 - 2008/07/07 (月) 19:44:20 - 細胞屋さん 『Potter型ホモジナイザーで』ーーpotter強すぎ。培養細胞の場合は普通はダンス型を使って手動で丁寧にやる。 『50strokes後』ーー50回多過ぎ。細胞によるけど大抵10回かもう少しくらいガラスを強めにすりつけるようにしてゆっくり上下すればいいと思う。ちゃんとこわれてるか心配なら顕微鏡でチェック。 培養細胞をPotter型ホモジナイザーで50回もやったら核もミトコンドリアも大変なことになってるような気がします。純度を気にされているようですが、分画といってもenrichmentという言い方のほうが実際を反映してると思います。だからあくまでも相対的にミトコンドリアrichのフラクションということで、他の画分も完全に排除する事はできません。(非常に高い純度を要求されるような実験ならば、密度勾配遠心法などを使うのが良いと思います。) WBのように高感度な方法だとどんなに上手にやっても、細胞質や核蛋白質もある程度は見えてくると思います。肝臓のような組織の場合だと通常はヘビーミトコンドリア画分とライトミトコンドリア画分に分けてとります。ライトのほうがヘビーの方よりミトコンドリアの純度たかいです。ヘビーにはペルオキシソームなども一緒に来ます。たぶん培養細胞でもそうではないかと思います。細胞分画に関する信頼できる詳しい実験書を用意して、それをもとにご自身の研究目的を考えて最適なmethodを選択するのがよいように思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1499-3 - 2008/07/07 (月) 12:48:10 - ミトコン Histone抗体では核画分以外にもミトコンドリア画分にバンドが検出されますし、Tom20抗体では核画分にもバンドが見え、核とミトコンドリアのどちらか一方だけが漏れ出している訳ではないので困っています。

(無題) 削除/引用 No.1499-2 - 2008/07/07 (月) 12:23:17 - おお どのようにうまくいきませんか?核にミトコンドリアが残るようでしたら、細胞がうまく壊れてない可能せい、壊れているなら1ど核フラクションを洗うなどのほうほうが必要かと思います。細胞の状態が悪いと、細胞膜を壊しただけで核のものがサイトゾルに流出して、ミトコンドリアや細胞質に流れ出てしまっている可能性もあります。核内のものを安定させたいならEDTAをのぞいて1mMぐらいのMg++を入れておくと良いでしょう。若干のK+(5ー20mM)も助けになると思います。塩濃度を少し上げることで核に弱く相互作用している細胞質のたんぱく質が幾らか外れてくれる可能性もありますね。 あとミトコンドリアのフラクションの遠心はもう少し強めのほうがいいのではと思います。20000-30000gぐらいでしょうか 。

ミトコンドリア分画について 削除/引用 No.1499-1 - 2008/07/07 (月) 11:40:28 - ミトコン 現在、COS-7細胞から得られるタンパクを核、ミトコンドリア、 その他の画分に分画しようとしています。しかし、ミトコンドリア画分と核画分がきれいに分画できず困っています。具体的なプロトコルは以下の通りです。 １、細胞をSTE buffer（0.25M sucrose、20mM Tris-HCl pH:8、0.1mM EDTA）　　で掻き取り、Potter型ホモジナイザーで50strokesホモジナイズ後1000g　　で5min遠心します。 ２、沈殿を核画分とし、得られた上清に対しては再び1000gで5min遠心しま　　　す。 ３、さらに、２で得られた上清に対して10000gで7min遠心します。 ４、３で得られた沈殿をミトコンドリア画分とします。 ５、これらの画分に対してsample bufferでタンパクを溶解させ、western 　　　blotを行います。核マーカーにはHistone H1を、ミトコンドリアマーカ　　ーにはTom 20の抗体を用いています。 分画を経験した方でどなたかご教授願えませんか。お願いします。

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