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ゲルシフトアッセイ（ENSA）におけるcpmとは？ トピック削除
No.1497-TOPIC - 2008/07/06 (日) 20:44:26 - りんか
ゲルシフトアッセイの条件設定を行うために、英語の文献に載っている方法をみているのですが、添加するDNAプローブの単位がcpmと書いてあります。調べると放射能の強度ということであり、まったくどのくらいの濃度で使うのか分かりません。どなたかこの単位の換算方法（molやngなど）などを教えてください。
　
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No.1497-7 - 2008/07/10 (木) 11:41:45 - AP
ちゃんと測定しようと思ったら、液体シンチレーションカウンターを使ってください。
DEペーパなどイオン交換濾紙の小片に1 uLなりをブロットして、シンチレータ液に入れて測定器にかけます。食塩水で洗浄してから行えば、フリーのヌクレオチドが混じっていてもこれを落とすことができるので、プローブに取り込まれた放射活性だけを量ることが出来ます。詳しくは、実験書を当たってください。

ありがとうございました。 削除/引用
No.1497-6 - 2008/07/10 (木) 11:14:57 - りんか
みなさんの説明わかりやすくて参考になりました。実際自分の持ってるのを測定してみたいと思います。
解決したのですが、暗証番号忘れてしまって・解決マークだせなかったのですが、これで終わります。あとEMSAのつづり間違っていて申し訳ありませんでした。本当におっちょこちょいで・・

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No.1497-5 - 2008/07/07 (月) 03:29:07 - おお
これは、使っているRIの比活性、ラベルの仕方にもよりますが、末端のgamma-ATP(3,000Ci/mmo1、10uCi/ul)によるラベルと考えるとします。gamma-ATPのPNKによる取り込みであればssDNA/RNAなど末端の形状によっては100%近い取り込みが期待できます。従って3,000Ci/mmo1のラベルされたssDNAが得られると言ってもいいかもしれません。20merのssDNAを想定すると3,000Ci/mmo1であれば0.45x10^-3Ci/ug=17,000kBq/ug=17,000,000dps/ug=1x10^9dpm/ug
という計算になります。Pの置換であればおそらく効率は半分ぐらいに落ちると思います。物によると効率は30%はキープと書いていますので、0.3x10^9dpm/ugの活性があればOKかなと思われますdpmからcpmへの置換は測っている機械、方法によりますのでそれについてはご自身でご確認ください。
またラベルのプロトコールによってはDNAが過剰になっていて半分ぐらい効率が落ちる物もあります。それを考慮すると0.1x10^9dpm/ugでもOKかもしれませんね。

(無題) 削除/引用
No.1497-4 - 2008/07/07 (月) 01:04:00 - カナマイシン
我々は実際（論文に堂々と明記するかどうかは別として）cpmなりcpsでやってます。
AP様のおっしゃる通り、プローブの絶対量は相当極端でない限りは通常問題ないので。
理想を言えば、ラベリングの効率等まで測定して、cpm/molとかにすべきなのでしょうが。

ではどうやってcpmやcpsを出すかというと、
プローブを 1 ul ピペットマンで吸い、放射線カウンター（ピッピッいうやつ）の前に
持っていって、値（うちのやつだとcps）をだいたい測る。
適宜蒸留水等で希釈。それだけです。

もちろんピペットマンのチップの材質や、放射線カウンターまでの距離で変化するので、
かなり適当な値であるとは思うのですが。

参考になれば。

(無題) 削除/引用
No.1497-3 - 2008/07/06 (日) 22:53:19 - えっと
>ゲルシフトアッセイ（ENSA）におけるcpmとは？

じゃなくてEMSAです。

(無題) 削除/引用
No.1497-2 - 2008/07/06 (日) 21:06:56 - AP
プローブの比活性、cpm/molとかcpm/ugなどの情報が書いてあれば、加えた放射活性を単純に割り算してやればでます。同じ放射活性量でも、比活性が低いプローブならば物質量としては多くなるし、比活性が高ければ少ない物質量ということになります。

gel shiftでは、どれだけの絶対量のプローブを入れるかとういうのは、あまり重要ではないともいえるので（相対量で量依存的な相関関係が見られれば良い）、絶対量にはこだわらず検出感度の目安として総放射活性量だけを記載している可能性もあると思います。

ゲルシフトアッセイ（ENSA）におけるcpmとは？ 削除/引用
No.1497-1 - 2008/07/06 (日) 20:44:26 - りんか
ゲルシフトアッセイの条件設定を行うために、英語の文献に載っている方法をみているのですが、添加するDNAプローブの単位がcpmと書いてあります。調べると放射能の強度ということであり、まったくどのくらいの濃度で使うのか分かりません。どなたかこの単位の換算方法（molやngなど）などを教えてください。
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