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(無題) 削除/引用 No.1496-4 - 2008/07/07 (月) 01:01:45 - in situ 恐らく、スレ主さんはRNAのqPCRによる絶対定量とDNAの絶対定量を取り違えているのではないでしょうか。 RNAの絶対定量を行う際は、RT(reverse transcription)効率が影響してくるため、スタンダードとして、濃度既知のin vitro transcriptionしたRNAを用い、段階希釈したものをサンプルと共にRT→qPCRということが良く行われます。 このときは、プラスミドをスタンダードにした場合、相対定量はできますが（同一遺伝子間の比較は可能）、絶対定量はできません。 DNAの場合、RTというステップがないので、スレ主さんが挙げている二つの方法どちらでも絶対定量可能だと思われます。

(無題) 削除/引用 No.1496-3 - 2008/07/06 (日) 14:16:59 - う〜んと （たぶんですが）一般的に、定量PCRで相対定量と呼ばれてるやり方は、例えば動物なら同じ固体内で別の組織間で何倍の違いがあるかというような計算の仕方です。 なので、このやり方ならプラスミドやPCR産物など純度の高い物質を定量のための標準物質となるようなものを用いません。 だから相対定量なのです。 ご質問の文章で１と２の違いは標準物質として用いるものがプラスミドDNAかPCR産物などのDNA断片かの違いだけで、どちらも一般的には絶対定量と呼ばれているやり方ですね。

(無題) 削除/引用 No.1496-2 - 2008/07/06 (日) 13:00:48 - おお > 2の場合も1と同様の方法で測定すればコピー数の算出→絶対定量出来そうな気もするのですが，なぜ駄目とされるのでしょうか？ > 2の場合はPCR時の塩基の置換や不純物が存在する可能性があるから駄目なのか？ > とか，そんなことも考えてみたり，調べてみたりもしましたが何せド素人故，これだから駄目！ > という理由が分かりません． > 絶対定量できます。ですからできないという理由が見つからないのだと思います。

リアルタイムPCR法におけるスタンダードの選択 削除/引用 No.1496-1 - 2008/07/06 (日) 12:50:24 - PCRできるかな PCRすらやったことの無いド素人なのですが，ある物に含まれているDNAのコピー数を知る必要があり， リアルタイムPCR法によって絶対定量を行う必要に迫られています． 色々と調べて見たところ，リアルタイムPCR法の検量線に用いる標準物質として， 　1．コピー数既知のプラスミドの段階希釈物を用いる方法(絶対定量)． 　2．PCR産物の段階希釈物を用いる方法(相対定量)． が有ることが分かりました． 1の場合，プラスミドのコピー数は波長260nmのO.D.値やPicoGreen等のインターカレーターによる蛍光測定から求められる事が分かりました． で，やっと本題です． 2の場合も1と同様の方法で測定すればコピー数の算出→絶対定量出来そうな気もするのですが，なぜ駄目とされるのでしょうか？ 2の場合はPCR時の塩基の置換や不純物が存在する可能性があるから駄目なのか？ とか，そんなことも考えてみたり，調べてみたりもしましたが何せド素人故，これだから駄目！ という理由が分かりません． もし，2の方法で絶対定量やそれに近い事がができるのであれば，そっちで進めたいと考えています． プラスミドの作成等の経験が皆無かつ業者に依頼するとかなりの金額が掛かる事が考えられるためです． 以上，よろしくお願い致します．

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