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(無題) 削除/引用 No.1485-14 - 2008/07/04 (金) 17:41:02 - AP RNAブロットの場合は低濃度のNaOHで加水分解してトランスファ効率を高めると言う方法もありますが、Rapid transferやVacuum botでなければ必要ないと思います。両刃の剣で分解されすぎて、シグナルが弱くなったり、低分子が失われたりする危険が大きいです。20x SSCでO/Nでトランスファする限りでは、高分子側もきれいにトランスファされているようですよ。 ほかのトピにもかきましたが、メンブレンにトランスファするのなら、メンブレン上でRNAを染めるのも簡単、安全で感度も悪くないです。染めたメンブレンをハイブリにもって行くこともできます（RNaseのコンタミだけは気をつけて）。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1338

(無題) 削除/引用 No.1485-13 - 2008/07/04 (金) 17:31:39 - Pumpkin >泳動後、NaOHによる変性（切断）は行っていますか？ RNAをメンブレントランスファーするのですよね。要りません。NaOHによる変性とHClによる脱プリンなどが混在しているように思えますが、ゲノミックサザンなどのように2本鎖だとか高分子だとかではありませんのでトランスファーに問題ありません。変性loading bufferで高次構造をほどくという変性も行っています。

(無題) 削除/引用 No.1485-12 - 2008/07/04 (金) 17:18:26 - ひろ いろいろとコメントをいただいているのですが、 結局、先に混ぜろとのことで納得いたしました。 原理まで教えてくださり感謝しています。

(無題) 削除/引用 No.1485-11 - 2008/07/04 (金) 17:16:56 - ひろ 見ていない間にこんなにもたくさんのレスをwww みなさんありがとうございます。 ホルムアルデヒド存在下ですと、ゲル全体が発色してしまうみたいですね。 とりあえず、Pumpkinさんのおっしゃっている方法でやってみます。 EtBr存在下でheat denatureしたほうが良く染まるんですか、、、知りませんでした。。。 架橋してしまって大丈夫なんですかね。。。 あともう一点お聞きしたいのですが、 泳動後、NaOHによる変性（切断）は行っていますか？ 中分子程度なので、やる意味があるのか、ないのかという感じですが、 10k以下ではあるので、 とりあえずやらない予定です。

(無題) 削除/引用 No.1485-10 - 2008/07/04 (金) 12:35:50 - ~ そういえば、この移動度を測りたいRNAはrRNAなのですか？ 目的のmRNAを見たくてpolyA+を流したけれどもバンドにならない、 といっているわけではありませんよね。

(無題) 削除/引用 No.1485-9 - 2008/07/04 (金) 12:01:31 - AP 少し補足 formaldehyde gelで後染めしようとしたら、formaldehydeをよく除かないと（SSCやDDWなどで長時間洗う）一本鎖であるRNAは染まりにくいですから、かなり染まりが薄くなり検出感度も一ケタくらいさがります。formaldehydeがあるとバックグラウンドの染色も強くなるようで、S/Nもひどく悪いですし。 ただし、formaldehydeを抜くために洗っているうちにRNAも拡散してバンドがぼけてきますから、いたしかゆし。シャープなバンドで移動度を計測したいなら、むしろサンプルにEtBrをいれる方法の方がいいのでは。 でなければ、メンブレンにトランスファしてからmethylene blueで染めるというほうほうもありますが。

(無題) 削除/引用 No.1485-8 - 2008/07/04 (金) 09:15:18 - AP >泳動度が重要なので、可能であれば、泳動後に染色したいと考えています。 先に書いた方法でも、移動度、トランスファ効率には大きな影響はないと思いますが、 どう目的の実験で「泳動度が重要」とはどの程度の話でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1485-7 - 2008/07/04 (金) 09:02:57 - AP formaldehyde denatured gel systemの場合、RNAサンプルにEtBrを加える方法の報告があります。ゲルにEtBrを入れないのでバックが低く、後染めよりも強く染色されるようです。どうやら、formaldehyde存在下ではRNAとEtBrが架橋かなんかで結合するみたいです。 初期にはheat denature後、EtBrとloading bufferを加えるというものでしたが、 Focus 10 issue 1, 5- http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf/focus.html 最近では、EtBr存在下でheat denatureしたほうが良く染まるというということで（EtBrとRNAの架橋が促進される？）、これが採用さることが多いようです。 http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=335174 Molecular Cloning第3版もそれに基づいていますね。

(無題) 削除/引用 No.1485-6 - 2008/07/04 (金) 08:35:30 - ~ >この場合泳動後に染色すると染色度合いがかなり弱くなってしまうのですが、 皆さん後染めを薦めていますが、すでに後染めはしているのですよね。 バックグラウンドが高いのでしょうか？ ほとんどが1本鎖なので、同じ量のDNAで考えているほどのバンドは見えないと思います。 対策としては、 ゲルを薄めに作る 染色後に脱染色して、ゲルに染み込んでいるEtBrを除く サイバーグリーンなど感度の高い染色剤を使う などはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1485-5 - 2008/07/04 (金) 08:14:17 - BBC 私はＰＣＲなどすべての核酸染色を後染めでやっています。 ゲルに入れるものより、後染めの方が感度よいです。 しかも、そんな手間もかからない気がします。

(無題) 削除/引用 No.1485-4 - 2008/07/03 (木) 22:01:18 - Pumpkin ちなみにモレクロでは、 RNA(up to 20ug) 2ul 10×MOPS 2ul formaldehyde 4ul formamide 10ul EtBr(200ug/ml) 1ul でサンプル調製してます。ノーザンであればRNA量を合わせて流していると思いますし、totalであればrRNAをマーカー代わりに使えると思いますが、やはり後染めですか。

(無題) 削除/引用 No.1485-3 - 2008/07/03 (木) 21:52:16 - Pumpkin ノーザンですか？ 後染色でなくともloading bufferに0.5mg/ml EtBrを入れて電気泳動していますが、特に問題ないですよ。

(無題) 削除/引用 No.1485-2 - 2008/07/03 (木) 21:16:46 - aaa 後染め。

RNAの泳動 削除/引用 No.1485-1 - 2008/07/03 (木) 19:19:42 - ひろ こんにちは。 RNAの電気泳動を1xMOPS、1%agaroseでおこなっていますが、 この場合泳動後に染色すると染色度合いがかなり弱くなってしまうのですが、 何か対策はありますでしょうか。 泳動度が重要なので、可能であれば、泳動後に染色したいと考えています。

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