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(無題) 削除/引用 No.1483-7 - 2008/07/05 (土) 00:00:37 - AP >[Re:6] 細胞さんは書きました : > 済みになっている所に申し訳ありませんが教えてください。 > たまに論文で45度くらいでハイブリしているものをみるのですが。一般的にやはりこのくらいのハイブリ温度では特異性は？でしょうか。 > > 以前に60度でin　situハイブリダイゼーションをして論文を出したところハイブリ条件が低すぎるのでやり直しなさいとレフェリーにいわれたことがあるので。プローブはROCHEのDIGプローブでした。 > 65℃くらいから初めて条件を設定していくのが一般的でしょうか？ > 教えてください。 buffer組成を書いてくれないとどうにも判断つきかねます。 >以前に60度でin　situハイブリダイゼーションをして論文を出したところハイブリ条件が低すぎるのでやり直しなさいと これがno formamideならstringencyは低めですが、50％ formaamide含有ならかなり高めですけれど

(無題) 削除/引用 No.1483-6 - 2008/07/04 (金) 21:52:22 - 細胞 済みになっている所に申し訳ありませんが教えてください。 たまに論文で45度くらいでハイブリしているものをみるのですが。一般的にやはりこのくらいのハイブリ温度では特異性は？でしょうか。 以前に60度でin　situハイブリダイゼーションをして論文を出したところハイブリ条件が低すぎるのでやり直しなさいとレフェリーにいわれたことがあるので。プローブはROCHEのDIGプローブでした。 65℃くらいから初めて条件を設定していくのが一般的でしょうか？ 教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1483-5 - 2008/07/03 (木) 15:38:07 - K 調べてみました。 プレハイソリューションにプローブが溶けている場合、 Tm=16.6xlog[Na+] + 0.41x(% GC)+81.5 T_hyb=Tm-25 で表されるとのこと。 根拠となる論文がありましたが、古すぎてAbstもありませんでした。残念。 この式でいくと、塩基長は考慮されず、GC含量のみを考慮すればいいということになります。 で、自分の配列に当てはめてみると、確かにTm=~95となり、 T_hybが70℃ とすれば、65℃で十分ハイブリッドが形成され得る と納得しました。 皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1483-4 - 2008/07/03 (木) 11:53:47 - K 皆様、迅速なレスポンスに感謝します。 >ラムダ様 >プローブは長さもGC含量も一律じゃないものの混合物になる 書き落としていました。 プローブはPCRの反応系にDIG-UTPを混ぜたもので、プローブ長は一定です。 >oligo nucleotideとおおよそ100 bpを越える核酸鎖では水素結合による対合のkineticsが全く違います。 >ある程度の長さ以上のプローブではTmが一律、90度以上になります。PCRの連想から言えばdenaturing stepは一律95℃くらいですね。 これは初めて知りました。勉強不足ですね。 調べてみます >私らがTmを知る入り口は、DNAのmelting現象やハイブリの手法からで、オリゴのTmは特殊な知識の部類だったのですが、最近の子らでは逆転してるんですね。 なるほど… 教授は「クローニングと言えば、ハイブリだった」と言っていたのを思い出しました。 今では、RACE-PCRによるクローニングが主流ですから、そうなっていたのですね。

(無題) 削除/引用 No.1483-3 - 2008/07/03 (木) 11:39:17 - AP >PCRでのアニーリングの温度からの連想で、 プローブの長さやGC含量によってハイブリの温度を検討する必要があると思うのですが、 どうなのでしょうか？ oligo nucleotideとおおよそ100 bpを越える核酸鎖では水素結合による対合のkineticsが全く違います。ある程度の長さ以上のプローブではTmが一律、90度以上になります。PCRの連想から言えばdenaturing stepは一律95℃くらいですね。 ハイブリ温度はTmマイナス30℃前後くらいで設定します。Tmが違わなければハイブリ温度も同じです。 時代は変わるものですね。私らがTmを知る入り口は、DNAのmelting現象やハイブリの手法からで、オリゴのTmは特殊な知識の部類だったのですが、最近の子らでは逆転してるんですね。

(無題) 削除/引用 No.1483-2 - 2008/07/03 (木) 11:31:11 - ラムダ プローブは長さもGC含量も一律じゃないものの混合物になるので、経験的にしか判断しようがありませんよね。クロスハイブリダイゼーションを利用したホモログ取りなどでないかぎり、65℃でまず大丈夫ということだと考えてよいと思います。

ハイブリダイゼーションの温度 削除/引用 No.1483-1 - 2008/07/03 (木) 11:13:34 - K ラムダファージに埋め込まれたcDNAのライブラリーからDIGプローブを用いて、 目的のcDNAのクローニングを行っています。 Rocheのマニュアルでは、ハイブリの温度は一律65℃で設定されています。 PCRでのアニーリングの温度からの連想で、 プローブの長さやGC含量によってハイブリの温度を検討する必要があると思うのですが、 どうなのでしょうか？ 65℃で上手く行かなければ、検討するということなのでしょうか？ よろしくお願いします。

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