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(無題) 削除/引用 No.1482-11 - 2008/07/08 (火) 13:30:04 - おお >[Re:10] なまくらさんは書きました : > NdeI は、クセのある酵素で、 たしかに、この酵素はあまり使いたくないですね。NEBのカタログのNde 1の所に、DNAが汚いと極端に切れにくくなるとも書かれてあったとおもいます。 毎回使おうと思った時やデザインを考えた時に酵素の特性をチェックするのがある意味成功する秘訣です。 今回はプライマーはもう作って始めていますので、行き詰まりそうであればPCRフラグメントを１度ブラントでクローニングベクターにほりこんでから、きりだす。 PCRフラグメントの末端を燐酸かまたはプライマーを燐酸かしてからPCRし、PCRフラグメントをライゲーションしてフラグメントが繰り返しつながっているコンカテマーを作ってから酵素処理するなどの工夫が出来ることを遅くなりましたが書き加えておきます。

(無題) 削除/引用 No.1482-10 - 2008/07/08 (火) 12:46:36 - なまくら NdeI は、クセのある酵素で、余分な塩基が 8bp 以上ないと切れない酵素です。 ミニプレッパー精製したものも切れないことがあります。 正直、NdeI は使わず、他の酵素サイトをつけたほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1482-9 - 2008/07/05 (土) 10:46:10 - おお DpnIを使うと、プラスミドを消化しますが、PCR産物は切れずに残ります。ゲルで分離した方が絶対にいいですが、、、

(無題) 削除/引用 No.1482-7 - 2008/07/03 (木) 13:09:48 - ats 追加です。8アミノ酸＝24bpならNdeI-BamHI断片は220bp vs 240bpで電気泳動で区別できるはず。

(無題) 削除/引用 No.1482-6 - 2008/07/03 (木) 13:06:51 - ats PCR産物を含む溶液をDpnIで消化すると、（大腸菌内でメチル化されたplasmid DNA=）鋳型DNAが切断されます。多少熱変成されていても部分的にアニールした部分で切断されるようです。ほとんどのPCRbufferで活性があります。 しかし、皆さんの意見に賛成で、ゲルから切り出すべきです。 （supercoil状態の）plasmidの形質転換効率はligationされたもの(open circle)より100倍以上（だったと思う）高いことを考慮しましょう。

(無題) 削除/引用 No.1482-5 - 2008/07/03 (木) 10:05:54 - L takaさんのおっしゃる通りだと思います。 プラスミドがテンプレートなら、1 ng でも十分な増幅が認められると思います。 50 ng/50 ul もプラスミドが存在するなら、形質転換でテンプレートプラスミドばかりが大腸菌に入って行くと思われます。 環状DNAが一番効率がいいので。

(無題) 削除/引用 No.1482-4 - 2008/07/03 (木) 09:57:14 - カナマイシン PCR増幅のテンプレには何を使われたのでしょうか？ 環状プラスミドをそのまま、だとすると、相当トランスフォーメーション効率が高いので、 やはりtaka様のご意見と同様ですがキャリーオーバーな気がします （50 ng/ul を 1 ul 使ってるならかなり多いですし）。 私も必ずゲル抽出のステップをはさみます。 ただ、環状プラスミドだと泳動時の移動度が読みにくいのがイヤですね。 私ならもとのプラスミドをNdeI / BamHI カットしてゲル抽出したものを テンプレにするかもしれません。 そうするとPCR増幅後に増幅産物とテンプレのバンドは重なってしまいますが、 増幅産物のほうが大過剰なので高い確率で拾えるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1482-3 - 2008/07/03 (木) 09:55:47 - PCR ＰＣＲ後の溶液には、ＰＣＲ産物とテンプレートプラスミドが含まれています。２つを分離せずに、工程を進めれば、テンプレートプラスミドで形質転換された大腸菌が生えてくるのは当然のことです。

(無題) 削除/引用 No.1482-2 - 2008/07/03 (木) 09:47:45 - taka テンプレートのキャリーオーバーの可能性が一番高いのではないかと思いますので、PCR産物はゲル精製してから制限酵素処理したほうがよいのではないでしょうか。 幸いPCRはうまくいっているようですので、それで問題は解決しそうな気がしますよ。

PCR Mutant Protein設計　トラブルシューティング 削除/引用 No.1482-1 - 2008/07/03 (木) 04:08:49 - るるる PCR Mutant Protein設計　トラブルシューティング： まず、pET21bというプラスミドに、NdeIサイトがN末端、BamHIサイトがC末端にある、Wild Typeの塩基配列が導入されているベクターがあります。 NdeI-----------------------------BamHI 　　<--------220bpぐらい--------> N末端とC末端に新たに、8つずつアミノ酸を加えたいので、下記のプライマーをデザインしました。 N末端プライマー： -------NdeI＊＊＊＊＊＊＊＊------------- <-7bp- > <---24bp-------><---20bp----> （テンプレートのNdeIを消すため、その場所は異なる配列をデザインした。） （7塩基、新しいNdeIサイトの前につけて、酵素で切りやすいようにした。） （テンプレートと重なる部分は〜20塩基ぐらい） C末端プライマー -------＊＊＊＊＊＊＊BamHI---　　　 （テンプレートのBamHIを消すため、その場所は異なる配列をデザインした） （3塩基、新しいBamHIサイトの前につけて、酵素が切りやすいようにした。） （テンプレートと重なる部分は〜20塩基ぐらい） もちろん上記のRev. Complement配列を使用 PCR反応： 10XPfx　Buffer　 　5ul　　　　　　　　　　　95度　　3min dNTP　　　　　　 　5ul 　　　　　　　　　　　95度　 30sec | Template(50ng/ul) 1ul　　　　　　　　　　　　50度　 30sec | Primers 　　　　　1ul each 　　　　　　　　　68度 　25sec | X25cycles MgSO4 　　　　　　1ul 　　　　　　　　　　　68度　　 3min DDW 　　　　　　　37ul 　　　　　　　　　　　4度 結果： バンドがキレイに出てました。PCR後は、ゲルPurificationせず、テンプレートとPCRプロダクトを分けずに精製し、制限酵素処理、CIAP処理（ベクターのみ）、ライゲーションなどなど行い。 ウキウキ気分でシーケンスを読んだのですが、なんとオリジナルのテンプレートの配列が読めていただけでした。。。PCRプロダクトは新しいプライマーにより増幅されたので、新しい配列がN末端とC末端に加わるはずなのですが。。。 なんででしょう。。。N末端とC末端にくっついたプライマーは、テンプレートとくっついている部分以外は2次構造を作り、酵素に増幅されなかったのでしょうか？　プライマーの配列は間違っていませんでした。テンプレートの量が多すぎですか？ゲルPurificationしたほうがよかったですか？どなたか同じような体験があった方いますか？ コメントよろしくお願いします。

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