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(無題) 削除/引用 No.1477-11 - 2008/07/06 (日) 01:07:45 - おお >[Re:10] 名無しさんは書きました : > 虚血による組織のダメージで蛋白質分解とかがけっこう起きて蛋白質の組成が結構変わってるか、 >なるほど、組織の壊死などが起こっているのならやも得ないで場合もあるでしょうね。タンパク量でそろえて、CBBの染色を見てみるのもいいかもしれません。MHCは組織がぼろぼろになっているキンジストロフィーの場合でもアクチンのようにインターナルコントロールとして使われます。分解されていくような状態でもきっと比較的動きにくいのだと思います。そういう意味でほかよりましという判断かもしれません。培養で細胞の分化をみているならMHCは分化にともない非常に強く誘導されるので使えないことが多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1477-10 - 2008/07/05 (土) 22:17:13 - 名無し 虚血による組織のダメージで蛋白質分解とかがけっこう起きて蛋白質の組成が結構変わってるか、それかアクチンそのものの発現が亢進して増えてるかしてるのでは。細胞骨格とか分解するカルパインとかのプロテアーゼ働きそうだし。特に虚血のあともし再還流とかもやってたら、酸化的傷害なんかがすごい起きるから程度によっては細胞も結構死にまくるし、組織では結構すごい事になってそうな気がする。処理した方がいつもそうなるなら、テクニカルなことでなくて、意味のある現象を観察していると考えて良いのではないかとわたくしは思います。あとミオシンヘビ鎖は結構分解受け易い気する。ふつうにホモジナイズやってもマスとかでみると低分子量の方にミオシンヘビ鎖の断片はよく出るから。

(無題) 削除/引用 No.1477-9 - 2008/07/05 (土) 15:22:37 - おお キン組織ではインターナルコントロールとしてミオシンヘビーチェーンを使うことがあります。あとみなさんのおっしゃるとおり溶出はしっかりさせた方がいいですね。

(無題) 削除/引用 No.1477-8 - 2008/07/03 (木) 17:26:01 - sea 確かに情報は限定されていますし一見奇妙に見えますが、 問題は下の2点かな、と思います。 ちなみに再現性はあるんですよね？ (1) 本当にタンパク量はそろっているのか (2) そろっている場合、アクチンが本当に増えているのか lysis bufferとタンパクの測定法の組み合わせや その他測定系を阻害するようなものが入っていると 当然ですが、タンパクは正確に測れていないことになります。 膜への転写がどうか、というのは別の問題ですが、 サンプルに余裕があれば、同じサンプルを二つのゲルに流し、 片方を転写しないでCBB染色、もう片方は転写した上でPonceauS などで染色、して本当に全体として同様のタンパクが流れているのか 確認できるでしょう。 これが問題ない場合、アクチン以外のinternal controlも 全部動いているのはやや不自然なので、抽出する際に 処理群の方はアクチンなどが含まれる細胞質画分が リッチになってしまっている可能性もありますね。 本当に調べる必要があるなら、その組織の免染などもして 実際に目的のタンパクとアクチンなどがどのように 組織で変化しているのか、見てみることも可能かな、と思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1477-7 - 2008/07/03 (木) 16:38:00 - emam 詳しく書かずに、申し訳ありませんでした。 マウスの筋組織をあつかっています。 骨格筋の虚血障害のモデルで実験しています。 おそらく、筋肉が障害されたことによって、筋肉のアクチンが多量に 溶解しているためかとと考えています。 抗体の種類を変えて工夫してみようと思っています。 ホモジナイズの方法など参考にさせていただきます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1477-6 - 2008/07/03 (木) 14:48:40 - りょう 骨格筋からの蛋白抽出は他の組織と比べて難しいです。 ホモジナイズ（本当に均一の状態にする）に工夫というか注意が必要だと思います。 buffer volume多めにして、ホモジナイズ後、４度でrotationしてしっかり抽出されることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.1477-5 - 2008/07/03 (木) 14:02:02 - 修士２年 本当にタンパク量はそろっておられるのでしょうか？ あるいは「処理」をすることで、タンパクがうまくSDS-PAGE-transfer-IBされないのか。

(無題) 削除/引用 No.1477-4 - 2008/07/03 (木) 12:46:01 - h-iz 系が良く分からないので何とも言えませんが…。 筋タイプによってもGAPDHやらb-actinやらといった遺伝子の発現量も相当変わってきますよ。

(無題) 削除/引用 No.1477-3 - 2008/07/03 (木) 12:29:29 - pippo 処置はどのような処置をしているのですか？

(無題) 削除/引用 No.1477-2 - 2008/07/03 (木) 10:44:36 - taka 材料は筋肉培養細胞ですか？それとも動物筋組織ですか？

筋肉のWB 削除/引用 No.1477-1 - 2008/07/02 (水) 21:21:24 - emam 研究初心者です。 諸先輩方のお知恵拝借できないでしょうか? 筋肉のWestern blottingを行っています。 contorolと処置をした筋肉とで、タンパクの発現を比較したいのですが、 タンパク量をそろえて泳動、blottingし、インターナルコントロールに アクチンを使うつもりで調べると、タンパク量をそろえているにもかかわらず、何十倍も処置したほうが多くなってしまいます。 筋肉のインターナルコントロールにアクチンが不適なのかと思い、a-tublinでも試しましたが、同様の結果でした。 何十倍も差があるのでアクチンをそろえようとすると、肝心のたんぱくが発現しなくなってしまいますし、正しい比較ができているとも思えません。 原因、何か良い対処方法あれば教えていただけないでしょうか?

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