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(無題) 削除/引用 No.1474-10 - 2008/07/06 (日) 20:06:25 - 中年 グリコーゲンはロットによっては牡蠣のDNAのコンタミがあると聞いたことがあります。私は値段も安い自作のLPAを使っています。 それはともかく、先にも書きましたが、μgのオーダーであるのに全く見えないというのはちょっと異常な事態だと思います。酢酸アンモニウムを用いてEtOH沈殿すると薄膜状になって見えにくいことがありますが、酢酸ナトリウムなんですよね？pHを変えたりはしていませんか？

(無題) 削除/引用 No.1474-9 - 2008/07/06 (日) 13:15:58 - おお >[Re:7] teaさんは書きました : > やはり腕の問題もあるようですね。 腕といってしまえばそうですが経験と観察力がスキルアップにつながると思います。ただ、チューブが多くなってくると一つ一つに気を使う時間を減らしていかざるおえないので、キャリアーをつかって無難に効率的に実験する方がいいかとおもいます。 > じつはエタ沈のあと、ライゲーションするのですが、キャリアを使うと何か影響してこないでしょうか？ グリコーゲンは具体的にどの程度影響があるかということははっきりとお答えできるほど使用経験はありませんが、通常のDNAフラグメントをプラスミドに入れる操作であればワークしていましたので(若干影響があったとしても)大丈夫だと思います。そのたPCRやよく使われる制限酵素、RTなどはまず問題ないかと

(無題) 削除/引用 No.1474-8 - 2008/07/06 (日) 08:41:47 - Pumpkin グリコーゲンなどは、適正な使用濃度下でその後の酵素反応を阻害しないことがわかっています。PCR産物のゲルからの回収などにグリコーゲンを使いますが、制限酵素反応、ライゲーション、カイネーションが阻害されたことはありません。また、A280, 260にも影響を及ぼさず、広範につかわれているキャリアーだと思います。

うーむ。。。 削除/引用 No.1474-7 - 2008/07/05 (土) 22:48:46 - tea ＞私はng単位で見えなくてもそれなりにこなせてます。 やはり腕の問題もあるようですね。じつはエタ沈のあと、ライゲーションするのですが、キャリアを使うと何か影響してこないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1474-6 - 2008/07/05 (土) 13:30:39 - おお 1.5mlのチューブだと、底がフラットになっているやつを使う人がいますね。そちらのほうが遠心した内側から、ピペットで回収しやすいからです。多分見えないのは精製の度合いが高いのだと私もおもいます。グリコーゲンやシグマ、ノバジェンなどが、色のついたキャリアーを売っていたりします。エタチンメイトってやつもありましたっけ。私はng単位で見えなくてもそれなりにこなせてます。

(無題) 削除/引用 No.1474-5 - 2008/07/03 (木) 07:01:46 - ~ エタ沈の上清がうまく捨てられない人には、 1本ずつペレットを見ながらチップで吸い取って、 吸い取った上清も別のチューブに取っておくことを薦めています。 透明でも、上清を捨てるとペレット部分は湿って見えると思います。 アスピレーターで吸い取ったり、デカンテーションで捨てるのは、 ペレットが流れ出したときに困りますので、 うまくいかないときは確認しながら操作できる方法のほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1474-4 - 2008/07/02 (水) 17:49:51 - 中年 きれいなDNAだと沈殿が見えにくいのは事実ですが、μgのオーダーであるのに全く見えないとしたら、沈殿が薄膜状に広く形成されているのかもしれませんね。夾雑物の性格かチューブの材質によるものでしょうか。 私もAPさん同様デカンテーションをお勧めします。乱暴な様ですが、廃棄される上清の水流（？）の具合か、剥がれてしまった沈殿でも流れ出さずにチューブに残ります。そのチューブを前と同じ方向に遠心機にセットして、フラッシュで遠心してからチップで残りの上清を除けば、撥水性のチューブ内壁に最後に濡れた沈殿が残るのが目視できると思います。

(無題) 削除/引用 No.1474-3 - 2008/07/02 (水) 17:30:57 - AP 純度の高いプラスミドがとれてるってことでしょうね。 純粋なDNAはよほど大量にないと見えないものです。 白く見えるのはほとんどの場合、不純物でして、プラスミド精製だと、きれいに除タンパクしても白く見える沈殿は、RNAだったりします。それでもPEG沈殿までするとほとんど見えません。 目で確認しながらやりたければ、glycogenなどの沈殿キャリアを加える方法もありますが、プラスミド精製のように収量が多いものではあんまりやらないです。 上清の取り除き方のコツにつきると思います。どのようにやってますか。 アングルロータにセットするときに、どちら側が遠心端になるかは決めていますよね。 私の流儀（というか多くの実験書には似たようなことが書いてあると思いますが）を書いてみると、 ピペットあるいはアスピレータで吸い出すときは、最初のうちはチューブをまっすぐ立て、あるいは遠心端が下になるように傾けて、チップの先端を反遠心端の壁に沿わせ、液面ぎりぎりに浸けて、液面が下がるのに合わせて、少しずつ下げていきます。液が残りわずかになってきたら、遠心端が上になるようにゆっくりチューブを傾け、上清が反遠心端に集めるようにします。液量が少なくなっていると、もし沈殿がはがれても流れ去ることなく途中で張り付くので、上清と沈殿を分離してから最後の吸い出しが出来ます。 あるいは、反遠心端の口からデカンテーションでも数が多いときなはいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1474-2 - 2008/07/02 (水) 17:02:00 - Pumpkin 量が少ない時にはペレットとして確認できないときも往々にしてあると思います。使用するローターでのペレットが形成される位置を確認しながら、上清を除去しましょう。ペレットを吸い出してしまっていることに気づいているのであればそれなりの対処をとった方がいいと思います。単に技術的な問題ではないでしょうか。 それでも、ペレットと液を分離できないとおっしゃるのであれば、グリコーゲンなどの共沈剤を使われてはいかがですか。青や赤などの色素を共有結合させたものもあります。

EtOH沈殿 削除/引用 No.1474-1 - 2008/07/02 (水) 16:56:45 - tea 　EtOH沈殿の際に、プラスミドが白い沈殿になりません。モノは取れているので、沈殿自体は形成されているようなのですが、白くなくて透明です。透明だと、それなりの確率で吸い込んでしまいます。特に複数のサンプルを並べてエタ沈するとき、後半のサンプルが失われてしまいます（たぶん底のほうに沈んでいて、透明なので気付かず、吸ってしまっているようです）。 　原因として考えられるのは何なんでしょうか？酢酸ナトリウムを作りなおしたのですが、効果なしです。プラスミドの組成、長さは関係ないように思います（何種類かのサンプルをエタ沈したのですが、どれも白い沈殿になりません）

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