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(無題) 削除/引用 No.1470-11 - 2008/07/02 (水) 16:29:23 - 素人 組織さん この本よさそうですね！チェックしてみたいと思います。 紹介ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1470-10 - 2008/07/02 (水) 15:13:38 - 組織 免疫染色の技法に関しては、このサイトでも紹介されている「酵素抗体法」という本が参考になると思います。 http://www.kenkyuu.net/books-03.html

(無題) 削除/引用 No.1470-9 - 2008/07/02 (水) 13:55:36 - 素人 > ラボのプロトコールに従ったほうがいいように思います。 実はラボを立ち上げ段階にあり、ラボのプロトコールが存在しません。今私が作り上げている段階です((+_+))別のラボに出入りしたり、本や雑誌、ネットで情報収集してる状態です。 ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）やＴＢＳでしていたのですが、ここにきてあるプロトコールにＤＷでリンスと書いてあったので、びっくりしました。やはり、あまりないようですね・・・。ここは今まで通り行いたいと思います。 > リン酸バッファーで５min や10min 等 すみません。間違えました。ご指摘の通り、リン酸ではなく、クエン酸バッファーです。いつもクエン酸でしています。ＥＤＴＡはすぐはがれますよね・・・。 > ブロッキングしてから、室温で放置するか、３７度で放置するか？ すみません。ブロッキングの反応温度のことです。色々調べた限り、室温で３０〜６０minとありますが、他のラボが室温ではなく、３７度でしていたので、気になりました。

(無題) 削除/引用 No.1470-8 - 2008/07/02 (水) 13:44:33 - 組織 今挙げられた条件だと3つとも大差ないように思いますので、他の方も言われているように、抗原賦活を最もシビアな（反応時間が長い）条件で統一して、あとはラボのプロトコール通りにされてはいかがでしょうか。これならあとは抗体濃度を振るだけで、切片の数もそれほど多くないでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.1470-7 - 2008/07/02 (水) 12:48:28 - 組織 免疫組織化学であれば、固定法、抗原賦活法、一次抗体濃度以外は、ラボのプロトコールに従ったほうがいいように思います。これ以外を変えても結果が大きく変わることはあまりないので。 > �@抗体希釈←これはそれぞれのメーカー推奨プロトコール通りにします 私もそうしてます。ただ、メーカーは確実にシグナルの出る濃度を設定する必要があるので、少し濃度が濃い（バックが出やすい）ことが多いです。ですので、私はいつもメーカーの推奨濃度と、それを10倍程度希釈した濃度で試しています。 > �A使用バッファーが違う > ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）かＤＷとなってます。 ラボのプロトコールに合わせればいいと思います。DWで洗うというのはあまりやりませんね。 > �B抗原賦活Autoclaveの時間 > リン酸バッファーで５min や10min 等 よほど長時間でなければ、反応時間を長くして悪くなることはないので、10 minでやってみてはいかがでしょう。ただ、リン酸バッファーを使うのはあまり聞きませんね。DW、クエン酸バッファー、EDTAあたりが一般的だと思います。データシートに載せている以上は、それで染まるのでしょうが。 > �Cブロッキングしてから、室温で放置するか、３７度で放置するか？ これが良くわからないのですが、ブロッキングの反応温度か、一次抗体の反応温度でしょうか？どちらにせよ37度はあまりやらないので、室温にするかラボのプロトコール通りにされた方がいいと思います。

ご意見ありがとうございます 削除/引用 No.1470-6 - 2008/07/02 (水) 11:40:38 - 素人 私がしようと思っているのは、免疫組織化学で、パラフィン切片を用いて行います。 ３つの抗体由来はマウスとウサギ２つです。人の組織に対して行います。 具体的に違う点は �@抗体希釈←これはそれぞれのメーカー推奨プロトコール通りにします �A使用バッファーが違う 特にwashで使用するバッファーが違います。ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）かＤＷとなってます。この２つで大きな違いはあるんでしょうか？ �B抗原賦活Autoclaveの時間 リン酸バッファーで５min や10min 等（細かいですが・・・(；一_一） �Cブロッキングしてから、室温で放置するか、３７度で放置するか？ 具体的にあげるとこの辺が違います・・・。

(無題) 削除/引用 No.1470-5 - 2008/07/02 (水) 11:09:52 - AP バッファに関しては、一般的に使われているような物であれば何を使っても大差ないと思います。ラボごとに流儀があるように、メーカーもどういうバッファを使うか流儀があって、それに従っているだけで、いろいろなバッファで試験するなんてしないだけだと思います。仮に、このバッファでなければうまく効きませんということがあれば、特記事項として記載されているはず。 反応時間と温度に関しては、メーカーの指示に従った方が良いと思います。 抗体ごとに抗原に対する結合係数が異なりますので、反応速度、複合体が安定する温度は当然異なるからです。例えば、特記事項として4℃O/Nで反応させるように書いてある抗体を、室温で反応させてうまくいかないということはあっておかしくないです。

(無題) 削除/引用 No.1470-4 - 2008/07/02 (水) 10:34:12 - 組織 免疫組織/細胞化学でしょうか、それともWBでしょうか？ 免疫組織化学であれば、凍結切片とパラフィン切片のどちらをお使いでしょうか？ 3つの抗体の由来動物やエピトープは同じでしょうか？ それによって話は変わってくるかと思います。 それと、具体的にどの手順が違うのか、差し支えなければ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1470-3 - 2008/07/02 (水) 09:55:44 - ~ 1.自分の標準の条件で行い、その条件で最もよい抗体を選択する 2.それぞれのメーカー推奨の条件で行い、最もよいプロトコル＆抗体の組み合わせを選択する 3.それぞれのメーカーの条件と、抗体を組み合わせて(この場合はプロトコル3x抗体3の9通り)、最もよい組み合わせを選択する のどれでもいいと思います。 私ならば、ラボで共通の試薬等があれば、まずは1で行い、 ラボでWBの系を新しく立ち上げようとするのであれば、2を選びます。

(無題) 削除/引用 No.1470-2 - 2008/07/02 (水) 09:41:20 - とう 人それぞれだと思いますので、参考意見としてですが。 基本は、メーカー推奨のプロトコールで行います。 でないと、何が悪いのかが判断しにくくなります、うまく行かなかったときは。 ベストのコンディションでやってみて、取捨選択するのが、結局早道の様な気がしますけど、 やっぱり面倒なので同一条件（それぞれのプロトコールのmix（条件指定の厳しいい所だけの寄せ集め））でやっても、結果は変わらない事が多いです。 つぼさえ押さえていれば、どっちでも良いって感じですね。 これでは参考にならないか、、、、

免疫染色のプロトコール 削除/引用 No.1470-1 - 2008/07/02 (水) 08:59:49 - 素人 初めて使う抗体をいくつか比較するとき、プロトコールはどうされてますか？ 例えば、A社、B社、C社の３つの抗体を比較する場合、それぞれのメーカーのプロトコールに合わせて、染色するか、それとも３つとも自分オリジナルのプロトコールで染色するか？（もしくはどこか１社のプロトコールで）ということです。 意味わかりますかね・・・？ メーカーによって、バッファーが全然違ったり、待ち時間等が異なっていて、迷っています。 みなさんはどうされてますか？

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