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何とか先が見えてきました。 削除/引用 No.147-7 - 2007/10/10 (水) 22:16:00 - 白帆 ats様 頂ましたご助言を参考に、1M betain、1M betain+5%DMSO添加、プライマーの 変更等、試みてきました。最終的には、プライマーの変更を行い、5%DMSOを添加し、ホットスタートの際の酵素を添加する温度と時間を変更することで１週間ほど前に、KOマウスのPCRバンドを見る事が出来ました。 まだ条件が万全でない為、肝心のバンドの増幅量が少なく、シーケンスを読む為の精製テンプレートが取れていないのですが、同一条件で、ワイルドの検体では増幅して来ないので、おそらくKOマウスの目的領域が増えているのだろうと考えています。 安心には早いですが、何とか、先が見えて来たようで胸をなでおろしています。お返事大変遅くなり、失礼しました。 お礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.147-6 - 2007/09/07 (金) 17:43:40 - ats 白帆さん アルカリでのボイル法はたくさんのサンプルを扱うための簡易法です。 アルカリで１本鎖に解離するので、多少は有利かも。 ProK処理の方がDNAの精製度は高いのでフェノ−ルの品質や残留に気を付けておけば、最良だと思います。PCR最初(cycle前）のdenatureを長め(5min)にしてみるのも良いかもしれません。 または、鋳型にPCR困難な配列（逆位反復配列、Tストレッチなど）がある（挿入されている）のかもしれませんね。primer dimerが生じるようですから、primer配列も検討の余地がありそうですね。 少しprimerが結合するゲノム部位をずらしてみてはいかがでしょうか。 なお、GC-richな鋳型なら、1M betain、1M betain+5%DMSO添加で増幅できたことがあります。

ありがとうございます。 削除/引用 No.147-5 - 2007/09/07 (金) 12:16:05 - 白帆 アドバイスを頂きまして、ありがとうございました。 お礼が遅くなりまして、申し訳ありませんでした。 私は、ats様が今回書いて下さった、アルカリでボイルする方法で なく、Protenase Kでタンパクを分解後、フェノール-クロロホルム- イソアミルアルコールでDNAを抽出し、エタノール沈殿で精製した DNAをPCRに使用しました。目的物の長さは〜650bpです。 アルカリでボイルする方法は、500bpは増幅し、1kbは増えなかった ということですが、Protenase Kを使用した方法との使い分けは、 増幅物の長さにより判断するのがいいのでしょうか。アルカリで ボイルする方法は、PCR反応を進める上で、利点があるのでしょうか。 反応に用いたDNA量は、多すぎたので、現在は10ng/25μl程度で反応させて います。DNAが入っていなくても、プライマーだけで反応してしまう ことから、プライマーが結合するより速く、DNAが複雑な構造を 取ってしまうのかなとも考えています。ホットスタートをかける際の、 自分のテクニカルな問題もあるとは思います。 ３年ほどですが、人のゲノムを扱った事があるのですが、ここまで PCRで増えなかった経験はないので思考錯誤しております。プライマーは、 ご助言頂きましたように、長めで作成してみます。

(無題) 削除/引用 No.147-4 - 2007/09/04 (火) 13:24:12 - ats 私のラボでKOマウスのgenotypingのプロトコールは以下のようです。 マウスの尾1-2mmをエッペンにいれ、300uLの50ｍM NaOHを加え、10分95度で保温します。voltex後、50uLの1M TriHCl(pH8)を加え中和後、５分遠心し、上清を取ります。 PCR反応液10-20uLに上清0.5-1uLを入れています。500bpくらいなら問題ないです。1kbは増えなかったと同僚は言っていました。 経験的に、voltexをしっかり行ってDNAを断片化しないと、PCR反応液に加える上清にDNAが含まれない（posiが増えない）ときがあります。また、精製したゲノムDNAを鋳型としたPCRでも、ゲノムDNAが多いとPCRがうまく行きません。primerがゲノムDNAに非特異的にハイブリして鋳型に結合できなくなるためかなと勝手に想像しています。 新たにprimerを設計するのでしたら、長め(25mer〜,Tm>60-65C)のprimerの方が至適条件が広く失敗が少ないです。

(無題) 削除/引用 No.147-3 - 2007/09/03 (月) 11:53:17 - 白帆 アドバイスを頂きましてありがとうございます。 やはりプライマーを変えるのがよいですか。 自分がKOを作成していれば、すんなり行くのですが。 プライマー変更、検討してみます。

同経験あり 削除/引用 No.147-2 - 2007/09/02 (日) 16:27:08 - KIO B6と129系マウスのヘテロで後者のみPCRで目的遺伝子が検出できないことがありました。 プライマーを変えてみることで対応できると思います。 原因は不明。 たぶん周囲の遺伝子構造などに問題があるのでは､と推測しましたが これを探求しても論文にはなりそうもないので特に探求していません。

KOマウスのゲノムの特徴について 削除/引用 No.147-1 - 2007/09/01 (土) 22:07:10 - 白帆 今、PCRを用いてKOヘテロマウスのジェノタイピングを行っているのですが、遺伝子導入したバンドが全く増幅せず、困っています。他のグループは、私が現在使用しているプライマーの配列で増えたと言っています。マウスは同種のKOマウスですが、同一マウスではありません。Mg2+, DMSO, hot startなど色々条件を振ってみたのですが、ゲノム自身に何か増幅を抑制する原因があるのではないか、と思えるほど増えず、プライマーダイマーのみ増えて来ます。KOマウスのゲノムに特徴的な事は何でしょうか。ご教示頂けますと幸いです。

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