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qPCRで陰性例を含む場合の統計処理 トピック削除
No.1467-TOPIC - 2008/07/01 (火) 16:11:28 - ビオ
実験群中にPCR陰性の検体がある場合の比較Ct法の統計処理についてご教授願います。

実験系を単純化して説明します。
現在2群(各10検体)の組織内にいる特定の菌の量を定量PCRで比較しようとしています。

検体組織自身の遺伝子を内因性リファレンスとして、菌遺伝子のCt値から引き算してdCt値を求めています。ただ、実験群にPCR陰性の検体があります。これは実験処理によって菌が減少、除菌された結果だと考えています。この系で実験群では対照群よりdCt値が大きく、「菌量が少ない」ということを示したいのですが、2群の各個体のdCt値を用いてt検定を行う場合、PCR陰性の検体についてはどのように扱えばよいのでしょうか。

またddCt値の平均値を計算して棒グラフにする場合にも、陰性の検体をどのように処理すればよいのか困っています。
ご存知の方がおられましたらお教えください。

いまのところ、PCRのサイクル数の最大値(私の場合は40)を陰性例のCt値と仮定して統計処理を行っています。検出限界で陰性となった場合、少なくともCt値は40を超えると思われるので、有意差が出たらそれを採用することにしていますが、これは妥当な方法でしょうか??
 
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No.1467-5 - 2008/07/07 (月) 11:00:09 - おお
>[Re:4] mom-aさんは書きました :
> 検出限界値以下の値の処理方法も様々あり、検出限界の下限値を代入して処理する方法もその一つですから、そんなに変なことはないと思います.

あ、そうか、ノンパラだと処理方法がありそうですね。連続でなく均等に区間を区切っても処理できるでしょうし。

(無題) 削除/引用
No.1467-4 - 2008/07/07 (月) 10:18:37 - mom-a
検出限界値以下の値の処理方法も様々あり、検出限界の下限値を代入して処理する方法もその一つですから、そんなに変なことはないと思います。(生物屋さんでなくて分析屋さんでもやる方法ですし。)とはいえ、絶対正しいというわけでもないし、違う意見もあるでしょうから、なるべく色々な意見がききたい…なんて、トピ主でないのですが。

>検出されない検体についてはN.Dにするほうがいいかと思います。

もちろんそれで正しいのですが、n=10の群の中にN.D.とそうでないものが混ざっていること、インターナルコントロールで補正をしようにも数値がでてこないと補正ができない、などが図表にするのに困るのでは。

全例数が少なければ、平均値とか計算しないで、検体ごとの全データを並べる(N.D.はN.D.として)というのも一つの方法かも。

検出限界以下になるということは無理に検定しなくても「差がある」と判断していいんじゃないか、と思います。
検出限界がどのへんに設定されているか、検出限界以下の例数が何例あるか、それをどう処理したか、がわかるようになっているかどうかということの方が大事なような。

(無題) 削除/引用
No.1467-3 - 2008/07/05 (土) 13:00:19 - おお
数字が出ないものを統計処理するには無理があるのでは、、、、
相対量でグラフをかき、検出されない検体についてはN.Dにするほうがいいかと思います。

(無題) 削除/引用
No.1467-2 - 2008/07/04 (金) 16:31:39 - mom-a
みなさん、どうなさっているのか興味があったのですが、レスがつかないようですね…。

実例を知っているわけでもないのですが、

>いまのところ、PCRのサイクル数の最大値(私の場合は40)を陰性例のCt値と仮定して統計処理を行っています。

↑この方法で良いと思います。というか、他にやりようがないですよね…。
ただ、データの分布が歪みますから、t検定ではなくてマンホイットニーのU検定を使われた方が良いと思います。

qPCRで陰性例を含む場合の統計処理 削除/引用
No.1467-1 - 2008/07/01 (火) 16:11:28 - ビオ
実験群中にPCR陰性の検体がある場合の比較Ct法の統計処理についてご教授願います。

実験系を単純化して説明します。
現在2群(各10検体)の組織内にいる特定の菌の量を定量PCRで比較しようとしています。

検体組織自身の遺伝子を内因性リファレンスとして、菌遺伝子のCt値から引き算してdCt値を求めています。ただ、実験群にPCR陰性の検体があります。これは実験処理によって菌が減少、除菌された結果だと考えています。この系で実験群では対照群よりdCt値が大きく、「菌量が少ない」ということを示したいのですが、2群の各個体のdCt値を用いてt検定を行う場合、PCR陰性の検体についてはどのように扱えばよいのでしょうか。

またddCt値の平均値を計算して棒グラフにする場合にも、陰性の検体をどのように処理すればよいのか困っています。
ご存知の方がおられましたらお教えください。

いまのところ、PCRのサイクル数の最大値(私の場合は40)を陰性例のCt値と仮定して統計処理を行っています。検出限界で陰性となった場合、少なくともCt値は40を超えると思われるので、有意差が出たらそれを採用することにしていますが、これは妥当な方法でしょうか??

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