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ありがとうございます２ 削除/引用 No.1458-8 - 2008/07/01 (火) 16:53:28 - タイ 皆様お忙しい中、ご意見頂きありがとうございます。 ＞まうすさん HAの情報ありがとうございます。ただ私の場合、pH 2~3ぐらいだと考えられるので、試してみないと分からないですね。try してみたいと思います。 ＞かんぽさん まず使用した抗GFP抗体ですが、市販・自作を含め複数使用しています。 ただし残念ながら、SDS有りの条件下だと、検出感度は相当低いです。 （native PAGEと以前比較したことがります） ですので、現時点では検出系に問題があるのではと思っています。 なので、変性しないタグに変更しようと思った次第です。 次に、分解についての可能性ですが、先行研究からしてその可能性は低いかと考えています。 が、分解の有無についてassayする方法を持っていないので、確信は持てないですが。 DsRed系については、mRFP・mCherry・tdTomatoを以前から使用してますが（抗体も自作）、 やはりpHを下げると（pH２〜３）、蛍光が消えます。 その後中性に戻すと蛍光は復活するのですが、輝度はかなり落ちます（GFPと同様です）。 とりあえず短いタグで試し、分解の有無についても検討してみたいと思います。 ＞pageさん 情報が不足していて申し訳ございません。pHは2~3程度です。 変性していると考えたのは、複数の抗体を使って検討した結果です。 （変性GFPに対する抗体の検出感度を以前に検討していたもので） 確かに組織内（小胞内）のpHを強制的に上げるのも一つの方法かと考えています。 PBSのpHを少し高めにした上で、固定液を流してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1458-7 - 2008/07/01 (火) 13:01:42 - page ＞恐らくは酸性下で変性した多くのGFPが、そのまま固定されてしまったのだろうと推測しています。 GFPはpH5程度であるならかなり安定だと思いますよ。もしGFPの蛍光が見えない ことを変成の理由としているのでしたら、それは違う可能性もあるかと思います。 GFPの蛍光は、マニピュレイトされた分子種でない限り、pH依存的です。 pH5程度ではほとんど蛍光はみることはできないでしょう。 組織内のpHを強制的に上げれば蛍光を検出できる可能性は高いです（もし十分 量のタンパク質が発現しているなら）。

(無題) 削除/引用 No.1458-6 - 2008/07/01 (火) 13:00:47 - かんぼ タイさんが使われた抗体の種類にも寄りますが、immunoblotでも使用可能な抗体であれば、GFPが変性したから無くなったというよりは、分解されたのではないでしょうか。リソソームなどの環境ではタグ自体が壊れたり、タグとつながった部分が切れたりして、結構難しいのですが、少なくとも、DsRed由来の赤い蛍光蛋白ー今ではmCherryがよく使われますがーは酸性環境でも比較的安定で、蛍光も出ます。ただ、タグ内にニックが入ることが多く、光っているものが、ほんとうにものと結合しているかどうかは、慎重な確認が必要になります。短いタグの場合でも同じ問題があり、なかなか難しいです。

HAタグ 削除/引用 No.1458-5 - 2008/07/01 (火) 12:48:51 - まうす ゴルジ体内部に局在化するタンパク質にHAタグをつけて、蛍光抗体染色で検出していました。ゴルジ体内部のpH (pH5-6程度)では、HAタグは使用可能だと思います。抗体は、SIGMAとNacalaiのanti-HA monoclonal antibodyを用いていましたが、どちらもきれいに染まります。

ありがとうございます 削除/引用 No.1458-4 - 2008/07/01 (火) 00:37:48 - タイ 「PG」さんが仰るとおり、PBSで中性化されるので問題ないと思っていたのですが・・・。 GFPを融合させて予備実験を行ったところ、抗GFP抗体では検出感度が非常に低い結果となりました。 恐らくは酸性下で変性した多くのGFPが、そのまま固定されてしまったのだろうと推測しています。 （小胞内のGFPのみ。細胞質に存在するGFPはきれいに検出できます） ですので、「A」さんがご指摘されているように短いタグで実験を組み直そうと考えていたところです。 ただし、これも「A」さんがご指摘されているように、タグ自体よりも抗体の性能が大きく影響するかと私も考えています。 どなたか、『タグ＆抗体』について同様のご経験がないかと思い、質問させて頂いた次第です。 とある論文に、脳組織では「AU1」が良いとの記載がありましたが（抗体はモノクロ市販）、 アミノ酸配列もpHに大きな影響を受けそうにないので、 とりあえず「AU1」で試そうかと考え中です。 他に良い候補がありましたらご教示よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1458-3 - 2008/07/01 (火) 00:13:26 - PG いずれにしてもPBS等で平衡化するので細胞内のpHは特に気にせずとも良いように思うのですが、いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1458-2 - 2008/07/01 (火) 00:05:49 - A 酸性条件下で安定なタグということですが基本的にはタグの種類よりも その酸性条件で抗体が上手く抗原を認識してくれるかにかかっている のでは？ ですから基本的にはどのタグでもいけるのではないかと思います。 ただGSTの様な大きなタグの場合、免疫染色に使う抗体が３次元構造を 認識しやすく、たまたま実験条件下で認識が甘くなる可能性は ありますから6xHis、FLAGなどの構造を持たない短いタグのほうが ベターかも知れません。 過去に同じような条件下、もし同じ条件下でなくとも同様または 近い組織を使って行われた免疫染色で上手く行っている「市販の抗体」 「タグ」の組み合わせはありませんか？もしそれが見つかれば 組織由来のバックが出てくる可能性が低いのではと想像しています。

酸性下でも安定なタグについて 削除/引用 No.1458-1 - 2008/06/30 (月) 19:12:21 - タイ あるタンパクXのC末にタグを付加し、ウイルスベクターを用いて神経細胞（in vivo）に発現させ、 免疫組織化学で（タグを）検出したいと考えています。 当該タンパクは小胞内に存在し、ATPaseによって酸性下に存在すると考えられます。 ですので、酸性下でも安定かつ免疫組織化学で検出出来るタグを現在検索中です。 もしご存知の方がいらっしゃいましたら、よろしくお願い致します。

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