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長ぇな・・・ 削除/引用 No.1452-11 - 2008/07/01 (火) 02:12:48 - そば なんとなく結論が見えている気もしますが、一応。 15%PAGEは硬過ぎるかも。てか、miRNA研究の初期の頃に使われていたゲルの濃度だと思いますよ（21と22ntを識別する、くらいのレベル）。 20-30nt程度を見たいというだけなら、もっと下げても良いと思います。その方が転写も簡単になりますし。 ただ、15%でもゲルにそんなに残ることはないと思うんですけどねぇ。 small RNAの転写にはエレクトロブロッティングの方が一般的だと思います。セミドライでもタンクでもOK。バッファーは0.5xTBEで問題無いです。 >低分子RNAのブロッティング時には長くやりすぎるとよくない 長過ぎると良くないのは間違い無い。だけど、短過ぎて転写されないよりはマシ。てか、バンドが検出されなくなるまで転写するってどれだけ転写すれば可能なんだろう？って感じです。 >きゅっとすぼまった低分子RNAがみられます。 Loading bufferを見直すべき・・・かも？ >多く入れすぎることで逆に分離、転写効率が落ちてしまっているのでしょうか？ 私の知り得る限り、100ugのtotal RNAを流してノザンを行った論文があります。30ugはちょっと多い程度。普通に流れると思います。 >通常のノーザンとsmallRNAのノーザンとで同じ感覚で操作してはいけない点 短いのでハイブリ可能な領域が狭く、厳密なハイブリ条件の検討が必要。 プローブも必然的に短くなるので、標識ヌクレオチドの取り込み効率も考慮すること。 ちなみに、問題の本質はハイブリ条件と検出方法だと思いますよ。 他の人も仰ってますけど、まずハイブリ条件が厳し過ぎる可能性が高い。 それと、DIG標識はそんなに高効率で入らないです（未標識塩基と同じ取り込み効率ということはまず有り得ません）。そのため、small RNA用に短いプローブを作る場合、いわゆるcold probeが出来てしまい感度が大幅に下がることがあります。 無理せず、RIで検討するのも1つの手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1452-10 - 2008/06/30 (月) 18:48:18 - くま パンタさま > アプリケーションマニュアルだとRNA:RNAの場合、ハイブリ温度は68度推奨ですが、miRNAとかだとハイブリの温度は40度くらいの低温でおこなうことが多いと思います。そちらは大丈夫でしょうか？ プローブにはPCR DIG Probe Synthesis Kitで作製したDNAプローブを用いています。DNA:RNAハイブリッドには50℃と記載されていましたので50℃でハイブリを行っておりました。これはかなり重要な私の間違いのようです。 そのときのプローブの種類や長さにかかわらず40℃前後で普通はやるものなのでしょうか？smallではRIの例を参考にしただけでしたので検出システムの通りでいいのだと思ってやっておりました。 > ちなみに僕がmiRNAを検出したときは、1レーンあたり15ugのtotal RNAを15%変性PAGE、20×SSCでキャピラリ転写（over night）でゲルの上の方のtRNAはUV下でで見えなくなるまでには転写されました。 > （くまさんの場合は低分子RNAを精製して15〜30ug使っていらっしゃるので、比較できないかも） overnightでtRNAが完全に転写されるまで転写をしても低分子RNAはちゃんと検出されていらしたということですね。 > あと教えていただきたいのですが、mirVanaで精製すると、miRNA（20merくらい）付近のバンドはエチブロで見えるようになりますか？ はい。10ug流したときでも見えました。 APさま > 目的のRNA付近の分子量マーカもEtBrで見えるくらい流しているのですよね。 > でしたら、マーカのトランスファされぐあいで、その分子量付近のトランスファ効率を検討できると思います。 過去の結果を見返してみると、濃い目に流したものがよく見るとうっすら見える程度に残っていました。どうやらまだ不十分と考えた方がいいようです。 > ブロット、固定済みのメンブレンをMethylene blueで染色してRNAを検出。 > http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1338 > transferの時にメンブレンを2枚ないし3枚重ねておいて、二枚目以降にRNAが検出されないかどうかチェック。 ありがとうございます。メチレンブルーで染色する方法は初めて知りました。確かにその状態でチェックできたら･･･と思うことがありました。メンブレンを重ねて置いてみて、以前より少し長めに転写をやりつつ様子を見てみようと思います。 具体的なご指摘をたくさんいただけてとてもうれしいです。 早速もう一度取り組んでみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1452-9 - 2008/06/30 (月) 17:30:33 - パンタ 話の腰を折ってしまうかもしれませんが、確認のため。 >> UV照射で固定はしていますよね。 >はい。DIGアプリケーションマニュアルに従って一通り行っています。 アプリケーションマニュアルだとRNA:RNAの場合、ハイブリ温度は68度推奨ですが、miRNAとかだとハイブリの温度は40度くらいの低温でおこなうことが多いと思います。そちらは大丈夫でしょうか？ ちなみに僕がmiRNAを検出したときは、1レーンあたり15ugのtotal RNAを15%変性PAGE、20×SSCでキャピラリ転写（over night）でゲルの上の方のtRNAはUV下でで見えなくなるまでには転写されました。 （くまさんの場合は低分子RNAを精製して15〜30ug使っていらっしゃるので、比較できないかも） あと教えていただきたいのですが、mirVanaで精製すると、miRNA（20merくらい）付近のバンドはエチブロで見えるようになりますか？

(無題) 削除/引用 No.1452-8 - 2008/06/30 (月) 17:03:43 - AP 目的のRNA付近の分子量マーカもEtBrで見えるくらい流しているのですよね。 でしたら、マーカのトランスファされぐあいで、その分子量付近のトランスファ効率を検討できると思います。 トランスファ後のゲルのEtBr染色で残っていないかどうか（これは見ているのですね）。 ブロット、固定済みのメンブレンをMethylene blueで染色してRNAを検出。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1338 transferの時にメンブレンを2枚ないし3枚重ねておいて、二枚目以降にRNAが検出されないかどうかチェック。

(無題) 削除/引用 No.1452-7 - 2008/06/30 (月) 16:51:34 - くま > アクリルアミドゲルで1 lane 30 ugというのはかなり多いですよね。 はい。最初は15μg程度にしていたのですがシグナルが検出できなかったので段階的に多く入れるようになってしまいました。今思えば最初の頃は手際が悪く量以前の問題も多数あったかと思いますが。 > total RNAですか、ある程度フラクションしているのでしょうか。 はい。Ambion社のmirVana miRNA Isolation Kitというものを使ってtotalRNA画分を除いてsmallRNA画分をカラム上で濃縮し溶出した液を得ています。 > それだけ大量に乗せると、分離が悪くなってバンディングがタイトではなくなってしまうかもしれません。totalだとrRNAが特定の位置に集中するので、かなり全体の分離や流れ方（rRNA以下がきゅっとすぼまったり）します。 > 必要であれば、RNA量を減らすとか、（少なくとも泳動を始めて、サンプルがすべてゲルに入りある程度さばけるまでは）低い電圧でゆっくり流すとか、工夫の仕方はあります。 まったくおっしゃるとおりでrRNA、tRNAの極太バンドの下にきゅっとすぼまった低分子RNAがみられます。 多く入れすぎることで逆に分離、転写効率が落ちてしまっているのでしょうか？ > >ノーザンの結果がきれいにでていません。 > 具体的にはどういう問題でしょうか。感度が足りない？　バンドがぼけてたり、汚れたりしている？ ありそうななさそうなバンドがあるようなないような･･･という雰囲気のものです。感度が足りないというのが率直なところです。 > UV照射で固定はしていますよね。 はい。DIGアプリケーションマニュアルに従って一通り行っています。

(無題) 削除/引用 No.1452-6 - 2008/06/30 (月) 16:26:51 - AP >メンブレンはRocheのポジティブチャージのナイロンメンブレンでポアサイズは0.45μmのものをつかっています。 妥当な選択だと思います。その種類だと0.2 umのはないですし。 同等品のPallのBiodyne plusのほうが厚みがある印象（Rocheのには厚さの情報がないので正確なところは分からない）があるので、こちらの方が若干有利かもしれません。 UV照射で固定はしていますよね。 アクリルアミドゲルで1 lane 30 ugというのはかなり多いですよね。 total RNAですか、ある程度フラクションしているのでしょうか。 それだけ大量に乗せると、分離が悪くなってバンディングがタイトではなくなってしまうかもしれません。totalだとrRNAが特定の位置に集中するので、かなり全体の分離や流れ方（rRNA以下がきゅっとすぼまったり）します。 必要であれば、RNA量を減らすとか、（少なくとも泳動を始めて、サンプルがすべてゲルに入りある程度さばけるまでは）低い電圧でゆっくり流すとか、工夫の仕方はあります。 >ノーザンの結果がきれいにでていません。 具体的にはどういう問題でしょうか。感度が足りない？　バンドがぼけてたり、汚れたりしている？

(無題) 削除/引用 No.1452-5 - 2008/06/30 (月) 15:35:30 - くま さっそくのコメントどうもありがとうございます。 APさま > メンブレンを選ぶアプリケーションだと思いますが、ブランド、種類、ポアサイズは？　もちろんポジティブチャージのナイロンですよね。 メンブレンはRocheのポジティブチャージのナイロンメンブレンでポアサイズは0.45μmのものをつかっています。 > miRNAでなくても、条件によってはメンブレンを通り抜けます。 > 極端に低分子量だと普通に起こりえますね。 > 電気的なトランスファは、移動力、流速が過剰になるのではないでしょうか。 > キャピラリーブロットも、リザーバからバッファーを供給しながらペーパータオルで連続的に吸い上げるのでは、流量が過剰だと思います。 自分では大きめのサイズのバンドがまだゲルに残ってたので転写が不十分だと感じていたのですが、目的とする小さなサイズのバンドにとってはやりすぎだったという可能性もあるのですね。 おおさま > 経験はないですがビスアクリルアミドの量にも左右されるかもしれません。エイどうパターンも変わりますけど、、、、 ビスアクリルアミド量が濃いと移動が遅くなるのですか？一度10％のゲルで試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1452-4 - 2008/06/29 (日) 20:40:00 - AP miRNAは扱ったこととはないのですが、 >低分子RNAのブロッティング時には長くやりすぎるとよくないといろいろなところに書いてあるのを読みましたがそれは分解してしまうからですか？それとも低分子すぎてメンブレンを通過（核酸でそんなことがあるかはわかりませんが）とかしてしまうからですか？ miRNAでなくても、条件によってはメンブレンを通り抜けます。 極端に低分子量だと普通に起こりえますね。 メンブレンを選ぶアプリケーションだと思いますが、ブランド、種類、ポアサイズは？　もちろんポジティブチャージのナイロンですよね。 電気的なトランスファは、移動力、流速が過剰になるのではないでしょうか。 キャピラリーブロットも、リザーバからバッファーを供給しながらペーパータオルで連続的に吸い上げるのでは、流量が過剰だと思います。 ゲルシフトやシークエンス（昔、スラブゲルで泳動してメンブレンにトランスファしてDIGでシークエンスラダーを検出する方法があった）で、メンブレンにトランスファしてDIGで検出するときは、泳動後のアクリルアミドゲルにメンブレンを重ねて（好みでクロマトグラフィ用濾紙を一、二枚重ねる）乗せて30分くらいおくだけのcontact blotで十分です。バッファはゲルに含まれるバッファだけです。その状態でハイブリバッグにいれて減圧する方法もありました。

(無題) 削除/引用 No.1452-3 - 2008/06/29 (日) 20:37:07 - おお > 低分子RNAのブロッティング時には長くやりすぎるとよくないといろいろなところに書いてあるのを読みましたがそれは分解してしまうからですか？それとも低分子すぎてメンブレンを通過（核酸でそんなことがあるかはわかりませんが）とかしてしまうからですか？ 通過はどの程度あるか分かりません。ただセミドライなどを使ったトランスファーなので、バッファーの消耗もあると思います。

(無題) 削除/引用 No.1452-2 - 2008/06/29 (日) 20:31:42 - おお 10%で、100あたりのをトランスファーしたことがあります。ウェルに近いところは流石に写りが悪いです。核内のRNAの電気へいどうでしたが、高分子側は多分サイトゾルからもちこんだrRNAとかではないかと思っています。条件はバイオラッドのセミドライのマニュアルに沿ってやりました(0.5xTBEで30-minぐらいだったと思います)。条件検討でtRNAは完全にトランスファーされていることが確認できています。 15%ではやったことはないのでよく分かりません(確かに15%で100だとたしかに少し大きいかもという感覚はありますが)。なにかそのあたりの長さのRNAでよういに検出できる位のRNAがあると、目的のあたりの長さのRNAのトランスファー効率が確認できますね。メンブレンはミリポアのポジティブチャージのものを使っていました。 経験はないですがビスアクリルアミドの量にも左右されるかもしれません。エイどうパターンも変わりますけど、、、、

ノーザンブロッティング（低分子RNA）の転写条件 削除/引用 No.1452-1 - 2008/06/29 (日) 19:19:22 - くま smallRNA解析初心者です。 羊土社のプロトコール本やを参考に実験を始めましたがノーザンの結果がきれいにでていません。 RNAは電気泳動と吸光度測定によって十分量単離できていると思います。またハイブリ以降DIG検出システムを用いているのですが、totalRNAのノーザンでも同じ方法行ってうまくいっているので問題ないかと思います。 今転写かプローブどちらかに問題があると思うのですが、 本人としましては転写が不十分かもしれないと感じているため まずは転写条件について教えていただけたらと思いここに書かせていただきました。 分離は〜30μg/laneのRNAサンプルを15%アクリルアミド（6M Urea）ゲルを1xTBEで泳動しています。 その後TBEバッファーで軽く洗浄したゲルを転写しています。 これまでに試したものはセミドライ式のブロッティング装置を用いてゲルと同じ大きさに切ったろ紙とメンブレンを0.5xTBEバッファーで浸し100mA,1h（冷室）といった条件での転写、または0.25xTBEバッファーで200mA,1h(冷室)、またキッチンペーパーを積み上げる一般的なキャピラリー方式でも20xSSCをもちいて4h(室温)してみました。これらの方法はどれも本に載っていたりウェブサイトにのっていたりしたものを参考にさせていただいたものなのですが 転写後のゲルをEtBr染色してチェックすると100bp程度以上の低分子の中でも大きいサイズのバンドがまだゲルに残っているのがはっきりとみえます。 実際に見たいサイズは20〜30merの大きさでそのあたりにはバンドが見えないからいいのかなと思っていたのですが、実際やっていらっしゃる方にお聞きしたいのですが、そんなものなのでしょうか？ 低分子RNAのブロッティング時には長くやりすぎるとよくないといろいろなところに書いてあるのを読みましたがそれは分解してしまうからですか？それとも低分子すぎてメンブレンを通過（核酸でそんなことがあるかはわかりませんが）とかしてしまうからですか？ 通常のノーザンとsmallRNAのノーザンとで同じ感覚で操作してはいけない点などがあるのでしょうか。 皆さんがきれいな結果を出すためにどのような点に気をつかっていらっしゃるのか、上の条件の気になる点などがありましたら どうかご教授ください。

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