@昆虫細胞は、一般にトリプシン処理が向いていないと聞きます。
下の方の指摘にあるように、単に培地にトリプシンインヒビターが
含まれていないことが理由かもしれません。
多くのプロトコールに指示されているとおり、私はスクレイパーを用いて剥離しています。
ガラス棒の先を細くしたものの先にシリコンゴムのチューブをかぶせた
自作ポリスマンでもよいそうですが、市販のスクレイパーを購入しています。
使い捨てはもったいないので、洗浄し、アルミホイルで包んで
オートクレーブ・乾燥して再利用しています。
AキアゲンのMaxi Kitで精製したプラスミドであれば、そのまま用いて大丈夫です。
Alkali-SDS法で抽出したものでも、途中にエタノール沈殿を経ているので
気にせずそのままトランスフェクションに用いています。
トランスフェクションにはNovagenのInsect Gene Juiceを用いています。
ふつうのTEに溶解したプラスミドを使っていますが、十分に導入されています。
（うちではBac-to-Bac Kitで得られた100 kb以上のバクミドを
トランスフェクトしていますが、TEで効率が低くなったりはしていません）
CCO2が不要なので大腸菌に用いるようなインキュベーターを28℃に合わせて使っていますが、
他の培養細胞用のCO2インキュベーターのように、
蒸留水を入れたバットをインキュベーター内に置いて加湿しています。
十分に加湿されるため、ディッシュで培養しても乾燥することはありません。
トランスフェクションの際に溶液が少ない場合も、大丈夫です。
（インキュベーターの機種によっては乾燥しやすいかもしれません） |
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