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多数のご返答ありがとうございました。 削除/引用 No.1449-10 - 2008/06/30 (月) 10:16:28 - よっしゃあ 皆様、多数のご返答ありがとうございました。 SDSバッファー使用時もインヒビターによる分解酵素阻害や熱処理による変性が重要であることが認識できました。 またSDSバッファー処理のサンプルの凍結保存にも問題はないとのことで安心いたしました。 ご紹介いただいた”ラボラトリーひとくちメモ”では「ＳＤＳ−ＰＡＧＥはサンプル調製がポイントです」という項があり、これも参考になります。 最後にこのようなすばらしいフォーラムの運営者や管理人の方々にも感謝の意を表します。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1449-9 - 2008/06/29 (日) 22:32:31 - コントロール これは蛋白によります。デリケートな蛋白は、「全体にＤＴＴか２ＭＥを所定量混じて、数分間のボイルをして回収蛋白全体を変性」しても、分解していったということを聞いたことがあります。 よって、フレッシュな調整と比べるなどのコントロールがいるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1449-8 - 2008/06/29 (日) 03:45:14 - おお みなさんの話の流れに沿っていますが、入れた方が無難です。 ボイルも調整した際にしておいた方がいいでしょう(DTTなどいれなくても) このボイルは酵素の早急な変性を期待しています。調整後すぐにやっておけば安心ということです。 すぐにSDSと熱で止めてしまうという考えです。

(無題) 削除/引用 No.1449-7 - 2008/06/29 (日) 01:58:43 - PG 私もインヒビター入れます。SDSで活性化するプロテアーゼすら存在しますしね。

(無題) 削除/引用 No.1449-6 - 2008/06/28 (土) 23:24:00 - K 一部のプロテアーゼはSDS存在下でもまだ活性があるとききます。 そんな理由から私はインヒビターカクテルを加えるようにしています。 もしくはサンプルバッファーを加える前に完全に変性（酸などで）させる 方法をとります。 また、カクテルを加えても長期保存せずにすぐGelを流すようにしています。 同僚にはサンプルバッファーのみで問題ないという人もいるので対象蛋白によるのかもしれません。 　凍結保存されたサンプルですが、凍結ー融解を繰り返すと分解することがあるので気をつけたほうがいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1449-5 - 2008/06/28 (土) 17:44:51 - よっしゃあ >[Re:3] Lさんは書きました : > 確かに、SDSは低温(4℃程度)では析出します。 > ですが、室温に戻してやれば、もしくはボイルすれば、ちゃんと溶けます。 > 凍結保存しているのでしたら、析出もなにもないと思うのですが。 > 凍結する前に、サンプルバッファーに還元剤は入れてもいいと思います。 > SDSサンプルバッファーで細胞を処理するのなら、インヒビターは不要ではないでしょうか。 了解です。 L様、ご返答ありがとうございました。

WB用のSDS sample buffer処理後のサンプル保存 削除/引用 No.1449-4 - 2008/06/28 (土) 16:55:22 - よっしゃあ 先ほどは書きかけでエンターキイーに触れてしまい中途半端な質問文になってしまい失礼いたしました。再度整理した形で投稿いたします。 現在、培養mouseマクロファージ系細胞でのMMPー９のWBを試みております。 蛋白収量の兼ね合いから細胞回収時のバッファーに１XSDS sample bufferを用いています。 ここで質問ですが、 皆様はこのような回収時のSDSバッファーにプロテインナーゼインビヒターカクテルを混ぜていらっしゃるでしょうか？それともSDSが入っている限り、たんぱく分解酵素同志の干渉は気にする必要はないでしょうか？そもそもSDSによってインヒビターカクテルの効力さえも阻害されてしまうので入れても無駄である可能性もありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1449-3 - 2008/06/28 (土) 16:40:17 - L PBSで洗うことで起きる影響について、トピックが建っていますので、議論はそちらに譲るとして 確かに、SDSは低温(4℃程度)では析出します。 ですが、室温に戻してやれば、もしくはボイルすれば、ちゃんと溶けます。 凍結保存しているのでしたら、析出もなにもないと思うのですが。 凍結する前に、サンプルバッファーに還元剤は入れてもいいと思います。 SDSサンプルバッファーで細胞を処理するのなら、インヒビターは不要ではないでしょうか。 こちらもまとまらない返信になってしまいました。 細胞からSDS-PAGEのサンプルを作ることについて、参考になるサイトがありますので、 "ラボラトリーひとくちメモ"で検索してみてください。

(無題) 削除/引用 No.1449-2 - 2008/06/28 (土) 16:32:29 - y >[Re:1] よっしゃあさんは書きました : > > 現在、１０ｃｍディシュの細胞（固着したmouseマクロファージRaw264.7）を > ＰＢＳで３回洗浄後に１ＸＳＤＳの泳動バッファー２００μをかけて、 > スクレイパーでかき取ったものを超音波処理すると成功しています。 > （この１ＸＳＤＳにはＤＴＴあるいは２−ＭＥは入っていません。 > 実際に泳動するために濃度を調節した際に初めて加えています。） > ここで質問なのですが、 > 「ＳＤＳは低温では結晶として析出する」という記述が成書にありました。 > そこで保存について心配になりました。 > （サンプルが回収されてから、実際にウェスタンに流されるまでに > １〜２週間以上は時間がかかる。） > 現在の１ＸＳＤＳ泳動バッファーと超音波で処理した蛋白サンプルは > このままで数ヶ月は凍結保存可能でしょうか？ > それとも、この処理したもの全体にＤＴＴか２ＭＥを所定量混じて、 > 数分間のボイルをして回収蛋白全体を完全に変性させてから凍結保存したほうが良いでしょうか？ > また、周囲の研究者で、ウェスタンをやっている人たちは、 > 細胞洗浄時にプロテアーゼインヒビターをいれたＰＢＳで洗い、細胞溶解液の > １ＸＳＤＳ泳動バッファーにはプロテアーゼインヒビターを入れていないようです。 > 目標とする蛋白によっても異なるのかもしれませんが、 > １ＸＳＤＳ泳動バッファーをライシスバッファーとするときは、このインヒビターは不要でしょうか？ > （ＳＤＳによって蛋白が変性するので阻害させるべきプロテアーゼの活性は抑えられるという理論） > 今ひとつまとまらない質問なのですが、何かとご教示いただきたくお願い申し上げる次第です。 >

SDS sample bufferto 削除/引用 No.1449-1 - 2008/06/28 (土) 16:25:10 - よっしゃあ 現在、１０ｃｍディシュの細胞（固着したmouseマクロファージRaw264.7）を ＰＢＳで３回洗浄後に１ＸＳＤＳの泳動バッファー２００μをかけて、 スクレイパーでかき取ったものを超音波処理すると成功しています。 （この１ＸＳＤＳにはＤＴＴあるいは２−ＭＥは入っていません。 実際に泳動するために濃度を調節した際に初めて加えています。） ここで質問なのですが、 「ＳＤＳは低温では結晶として析出する」という記述が成書にありました。 そこで保存について心配になりました。 （サンプルが回収されてから、実際にウェスタンに流されるまでに １〜２週間以上は時間がかかる。） 現在の１ＸＳＤＳ泳動バッファーと超音波で処理した蛋白サンプルは このままで数ヶ月は凍結保存可能でしょうか？ それとも、この処理したもの全体にＤＴＴか２ＭＥを所定量混じて、 数分間のボイルをして回収蛋白全体を完全に変性させてから凍結保存したほうが良いでしょうか？ また、周囲の研究者で、ウェスタンをやっている人たちは、 細胞洗浄時にプロテアーゼインヒビターをいれたＰＢＳで洗い、細胞溶解液の １ＸＳＤＳ泳動バッファーにはプロテアーゼインヒビターを入れていないようです。 目標とする蛋白によっても異なるのかもしれませんが、 １ＸＳＤＳ泳動バッファーをライシスバッファーとするときは、このインヒビターは不要でしょうか？ （ＳＤＳによって蛋白が変性するので阻害させるべきプロテアーゼの活性は抑えられるという理論） 今ひとつまとまらない質問なのですが、何かとご教示いただきたくお願い申し上げる次第です。

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